武香玉，徐海燕，辛國(guó)芹，曹銀生，汪孟娟，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

益生元是指一些不被宿主消化吸收卻能有選擇性地促進(jìn)其體內(nèi)雙歧桿菌等有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)。益生元不僅具有低熱、穩(wěn)定、安全、無(wú)毒等理化性質(zhì)，而且能夠提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率，促進(jìn)生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫力[1]。屬于益生元的有功能性低聚糖類、多糖類、一些天然植物提取物、蛋白質(zhì)水解物、多元醇等，目前研究主要集中在低聚糖類物質(zhì)，主要包括菊粉（Inu?lin）、低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽糖（IMO）、低聚乳果糖（LACT）、大豆低聚糖（SOS）、水蘇糖、棉籽糖等。由于機(jī)體胃腸道內(nèi)缺乏水解這些益生元的酶系統(tǒng)，因此其大部分可順利通過(guò)小腸和胃而不被降解利用，直接進(jìn)入大腸內(nèi)為雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌所利用，有害菌利用率極低或不能利用，從而使有益菌大量生長(zhǎng)繁殖[2]。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同益生元對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響，為益生元制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雙歧桿菌：青春雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌；乳酸菌：嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌；病原菌：大腸桿菌及沙門(mén)氏菌。

1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基，雙歧桿菌培養(yǎng)基采用改良的TPY培養(yǎng)基，大腸桿菌及沙門(mén)氏菌采用肉湯培養(yǎng)基[3]。

1.3 低聚糖

低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖、低聚半乳糖及及甲殼素。

1.4 菌株活化

將雙歧桿菌接種于TPY培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，分別涂片、染色、鏡檢，備用。

將大腸桿菌及沙門(mén)氏菌接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)約18 h，涂片、染色、鏡檢，備用。

1.5 不同益生元對(duì)雙歧桿菌及乳酸菌生長(zhǎng)的影響

對(duì)雙歧桿菌，每種益生元按一定濃度添加于TPY培養(yǎng)基中，對(duì)照不加益生元，接種雙歧桿菌，37℃厭氧條件培養(yǎng)48 h，測(cè)定活菌數(shù)。

對(duì)乳酸菌，每種益生元按一定濃度添加于MRS培養(yǎng)基中，對(duì)照不加益生元，接種乳酸菌37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定活菌數(shù)。

對(duì)病原菌，將每種益生元按一定濃度添加于肉湯培養(yǎng)基中，對(duì)照不加益生元，37℃振蕩培養(yǎng)18 h，取出測(cè)定活菌數(shù)。

1.6 活菌計(jì)數(shù)

采用平板滴注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)好的菌液倍比稀釋，取合適稀釋度菌液，以滴注法點(diǎn)種在相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，厭氧或需氧培養(yǎng)，24或48 h后計(jì)數(shù)每一稀釋度的細(xì)菌菌落數(shù)。每毫升菌液中的活菌數(shù)（cfu·mL-1）為細(xì)菌菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100/3，結(jié)果換算成以10為底的對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件中的單因子方差分析，用LSD進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生元對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響結(jié)果

不同益生元在相同的添加量下對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同益生元對(duì)雙歧桿菌增殖促進(jìn)作用的體外試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，不同益生元對(duì)雙歧桿菌的影響效果不同，同種益生元對(duì)不同雙歧桿菌的作用效果也不同。對(duì)青春雙歧桿菌來(lái)說(shuō)，水蘇糖和甲殼素與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），水蘇糖能促進(jìn)其生長(zhǎng)，其他糖與對(duì)照相比差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌來(lái)說(shuō)，低聚異麥芽糖與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），能促進(jìn)其生長(zhǎng)。對(duì)嬰兒雙歧桿菌，低聚果糖效果與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），與其他糖相比效果不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同益生元對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)影響結(jié)果

不同益生元在相同的添加量下對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同益生元對(duì)乳酸菌的增殖促進(jìn)作用體外試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，不同益生元對(duì)乳酸菌的影響效果不同，同種益生元對(duì)不同乳酸菌的作用效果也不同，總體來(lái)說(shuō)益生元對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。對(duì)鼠李糖乳桿菌來(lái)說(shuō)，與對(duì)照相比6種益生元均差異顯著（P＜0.05），其中以甲殼素增殖作用最為顯著（P＜0.05），木寡糖、低聚異麥芽糖能促進(jìn)其生長(zhǎng)，效果顯著（P＜0.05）；0.5%乳果糖能促進(jìn)其生長(zhǎng)。對(duì)植物乳桿菌來(lái)說(shuō)，甲殼素、低聚異麥芽糖與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），有增殖效果，水蘇糖也有顯著差異（P＜0.05），但是抑制菌的生長(zhǎng)，其他糖差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)嗜酸乳桿菌來(lái)說(shuō)，6種糖與對(duì)照相比差異均不顯著（P＞0.05）。對(duì)嗜熱鏈球菌，水蘇糖與對(duì)照比差異顯著（P＞0.05），促進(jìn)菌的生長(zhǎng)；甲殼素抑制菌生長(zhǎng)，其他糖顯著無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 不同益生元對(duì)病原菌的生長(zhǎng)影響結(jié)果

不同益生元在相同的添加量下對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同益生元對(duì)病原菌的影響體外試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，不同益生元對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制作用不一樣，個(gè)別益生元對(duì)兩種病原菌的生長(zhǎng)都有抑制作用。對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)，甲殼素和低聚半乳糖與對(duì)照組相比抑制效果顯著（P＜0.05），其他無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)沙門(mén)氏菌來(lái)說(shuō)，低聚半乳糖與對(duì)照相比抑制效果顯著（P＜0.05）。其中低聚半乳糖對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌都有顯著地抑制效果（P＜0.05）。

3 討論

3.1 益生元的益生功能

近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者們對(duì)低聚糖類益生元益生功能的評(píng)價(jià)作了大量研究，張帆等和項(xiàng)明潔等研究表明，低聚果糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌和乳桿菌的作用[4]。項(xiàng)明潔等在厭氧菌液體培養(yǎng)基中加入低聚果糖，結(jié)果表明，在厭氧菌液體培養(yǎng)基中加入低聚果糖前后雙歧桿菌菌數(shù)分別為1.5和3億·mL-1，低聚果糖對(duì)雙歧桿菌有增殖效果，對(duì)人體腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用[5]。任林等研究表明，甲殼低聚糖可增殖小鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量[6]。顧清等研究結(jié)果表明，異麥芽低聚糖對(duì)BALBc小鼠和受試人群的腸道菌群均有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)小鼠和人腸道的雙歧桿菌和乳桿菌有增殖作用，并具有抑制腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的作用[7]。邰秀林等試驗(yàn)證實(shí)，低聚果糖能防止早期斷奶犢牛腸道萎縮，維持腸道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高犢牛免疫性能[8]。杭鋒等試驗(yàn)結(jié)果表明，低聚果糖能促進(jìn)乳桿菌和雙歧桿菌的增加并抑制腸桿菌和腸球菌的增幅[9]。羅予等試驗(yàn)也證實(shí)，低聚果糖在體內(nèi)外均有相對(duì)選擇性增殖雙歧桿菌的作用，對(duì)類桿菌和腸桿菌也有調(diào)整作用[10]。本研究中水蘇糖、低聚麥芽糖和低聚半乳糖均能不同程度的促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的生長(zhǎng)，說(shuō)明這3種糖都可以被有益菌分解利用，均可作為有益菌的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，且低聚半乳糖對(duì)病原菌有很好的抑制作用。

3.2 益生元的作用機(jī)制

益生元在消化道中不被機(jī)體降解利用，但可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被腸道有益菌利用，使有益菌大量增殖，被發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸、短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)[11]。乳酸可直接作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被機(jī)體吸收，還可作為殺菌劑抑制腸道中的病原菌；短鏈脂肪酸可通過(guò)降低腸道pH，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)通過(guò)降低腸道氧化還原電位Eh，調(diào)節(jié)腸道正常蠕動(dòng)，間接阻止病原菌在腸上皮細(xì)胞的黏附定植，提高動(dòng)物的抗病能力。

3.3 益生元的抑制作用

病原菌細(xì)胞表面的外源凝集素和腸道黏膜上皮細(xì)胞能夠結(jié)合，使病原菌在腸壁上定植和繁殖，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。當(dāng)腸道內(nèi)存在一定量的低聚糖時(shí)，外源凝集素能與低聚糖結(jié)構(gòu)的受體相結(jié)合，從而減少了與腸黏膜上皮細(xì)胞的結(jié)合機(jī)會(huì)，破壞細(xì)胞識(shí)別而不吸附到腸壁上，從而增強(qiáng)有益菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。曉卉研究結(jié)果表明，添加低聚糖可抑制病原菌的黏附定植和繁殖，從而減少疾病的發(fā)生[12]。

3.4 益生元的應(yīng)用價(jià)值

由于低聚糖具有能被益生菌利用、給益生菌提供營(yíng)養(yǎng)及有害菌難以利用的特點(diǎn)，按照仿生學(xué)的原理，若益生元與益生菌合理配伍，更有利于恢復(fù)和維持腸道微生態(tài)平衡，使腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群迅速增殖，阻止病原菌的侵襲。本研究結(jié)果表明，水蘇糖、低聚麥芽糖和低聚半乳糖均能不同程度的被有益菌分解利用，作為有菌的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的生長(zhǎng)，所以可將其配伍，應(yīng)用于腸道微生態(tài)平衡的恢復(fù)及其他疾病的預(yù)防。

[1]陳代文,張克英,王萬(wàn)祥,等.酸化劑、益生素和寡糖對(duì)斷奶仔豬糞中微生物菌群和免疫功能的影響及其互作效應(yīng)研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2006,18（3）:172-178.

[2]熊德鑫,李劍秋,徐殿霞,等.低聚糖體外選擇性促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的研究[J].食品科學(xué),1998,19（6）:34-36.

[3]張剛.乳酸細(xì)菌——基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

[4]張帆,汪會(huì)玲,孟晶.低聚果糖對(duì)人體腸道菌群的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33（2）:158-159.

[5]項(xiàng)明潔,劉明,彭奕冰,等.低聚果糖對(duì)雙歧桿菌增殖效果及腸道菌群的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2005（1）:49-51.

[6]任林,李邦良,高仕瑛,等.甲殼低聚糖對(duì)糖尿病小鼠血糖和腸道菌群的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志,2001,22（5）:227-229.

[7]顧清,楊溢,江國(guó)虹,等.異麥芽低聚糖對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[J].衛(wèi)生研究,2003（1）:54-51.

[8]邰秀林,龍翔,向釗,等.低聚果糖對(duì)早期斷奶犢牛腸粘膜和免疫指標(biāo)的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2009,45（7）:36-39.

[9]杭鋒,郭本恒,龔廣予,等.低聚果糖對(duì)小鼠腸道菌群影響與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)關(guān)系的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2009（5）:205-211,231.

[10]羅予,孟林敏,毛理納,等.低聚果糖體內(nèi)外對(duì)腸道菌的影響[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2003,15（6）:10-11.

[11]羅予,蔡訪勤,趙國(guó)新,等.異麥芽寡糖促進(jìn)腸道分離菌生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2000,12（5）:14.

[12]曉卉.低聚糖體外促進(jìn)腸道有益菌增殖的研究[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2009,39（2）:15-16.