丁艷霞，郭洋靜，曾令連，李 欽＊

（1.河南大學(xué)藥學(xué)院 杜仲工程研究中心，河南 開(kāi)封 475001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名思仙、思仲、石思仙，為杜仲科杜仲屬植物，落葉喬木，花單性異株，是僅存于我國(guó)的第三紀(jì)孑遺植物［1］，是中國(guó)珍稀瀕危二類保護(hù)植物［2］，它的栽培歷史悠久，廣泛分布于甘、陜、晉、豫、湘、鄂、川、滇、黔、桂、皖、浙、贛、閩等省、自治區(qū)的平原到海拔1690m 間的丘陵和山地［3］。杜仲作為藥材在我國(guó)已有2000多年的歷史，我國(guó)第一部藥書(shū)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載了杜仲的藥效：“杜仲性味甘、微辛、溫、無(wú)毒，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益腰膝、除酸痛的效能”。肖靜等通過(guò)提取杜仲皮中總黃酮，以25、50、100μg／mL 濃度分別加入新生Wistar大鼠顱骨分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)杜仲總黃酮能直接促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖［4］。杜鵬等［5］報(bào)道，杜仲總黃酮能對(duì)抗維甲酸誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥，提高成骨細(xì)胞活性。國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲黃酮類化合物的研究十分活躍，已有研究［6］表明，杜仲雄花中的總黃酮含量遠(yuǎn)高于杜仲皮和葉，關(guān)于其總黃酮的富集主要采用大孔樹(shù)脂，黃酮純度最高能達(dá)到33.9%（粗提物中黃酮純度為3.28%）。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)聚酰胺－大孔樹(shù)脂聯(lián)用技術(shù)富集杜仲總黃酮進(jìn)行了探討，取得較好效果，富集物純度提高近200倍，遠(yuǎn)優(yōu)于目前常用的黃酮純化技術(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV－2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海龍尼柯儀器有限公司）；XS225A型分析天平（瑞士普利賽斯公司）；GKC21CR4可控硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥

X－5、HPD－100、AB－8、NKB－9、D－101大孔吸附樹(shù)脂（天津市海光化工有限公司），柱色譜用聚酰胺（100～200 目）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；杜仲雄花藥材購(gòu)自洛陽(yáng)市雞冠山商貿(mào)有限公司，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院李欽教授鑒定均為杜仲科植物杜仲Eucommia uimoids Oliv.的雄花；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；所用試劑均為分析純。

2 分析方法的建立

2.1 對(duì)照品溶液的制備及線性方程

取105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約9.48mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶解定容成0.1896 mg.mL－1的溶液，即得。

分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4mL置于10mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉0.4mL，混勻，放置6 min，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硝酸鋁0.4mL，混勻，放置6min，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.3%的氫氧化鈉4.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以空白為對(duì)照，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為510nm，并在510nm 下測(cè)定各濃度標(biāo)樣的吸光值，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y＝11.314 X＋0.028，R2＝0.9997。

2.2 供試品溶液的制備及測(cè)定方法

取杜仲雄花粉末適量，25 倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡2h，浸泡液用超聲波120 W，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取2次，每次20min。濾過(guò)，減壓回收溶劑至無(wú)醇味，殘?jiān)?0%乙醇溶解，并稀釋至質(zhì)量濃度為0.016g／ml（按浸膏量計(jì)），作為上柱供試液，并按照文獻(xiàn)方法［7］，測(cè)定藥材中總黃酮的含量為3.2%。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚酰胺靜態(tài)吸附量－解吸性能考察試驗(yàn)［8］

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的聚酰胺5.00g，置于250mL具塞錐形瓶中，加入樣品溶液（總黃酮濃度1.03 mg／ml）50mL，平行六份。每隔30 min振搖20s，每隔1.5h吸取上層液測(cè)定藥液的吸光度，至剩余總黃酮濃度達(dá)到平衡，計(jì)算出每克干聚酰胺的吸附量（mg／g）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，得到聚酰胺的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)考察，其吸附在0.5h內(nèi)吸附速率最快，0.5～5h以內(nèi)吸收變得緩慢，但6～15h后吸附的速率又一次加快快，到15h后趨于平衡狀態(tài)。按式（1）計(jì)算吸附量和每克干聚酰胺的吸附量，結(jié)果表明：平衡狀態(tài)時(shí)，5g聚酰胺樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量為37.71mg。

吸附量＝原液總黃酮量一剩余總黃酮量（1）

圖1 聚酰胺靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線圖

3.2 聚酰胺動(dòng)態(tài)吸附量－解吸性能考察

將3.1 項(xiàng)預(yù)處理的飽和吸附黃酮的聚酰胺5.00g，裝入內(nèi)徑為1.5cm的層析柱，分別用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、95%的乙醇各100ml，以流速為2BV／h對(duì)雄花藥液（總黃酮濃度1.03mg／ml）50 ml進(jìn)行沖洗，收集各洗滌液，按照供試品溶液的測(cè)定方法測(cè)定各溶液的吸光度（A），計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸量及解吸率。結(jié)果表明：用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗脫，能使黃酮的解析量達(dá)到33.01mg，解析率達(dá)到87.5%。

表1 聚酰胺對(duì)黃酮的動(dòng)態(tài)吸附量－解吸情況

表2 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)總黃酮吸附洗脫效果

3.3 大孔樹(shù)脂型號(hào)的篩選

準(zhǔn)確取等量不同型號(hào)大孔樹(shù)脂，預(yù)處理后裝柱，以水洗脫至流出液近無(wú)色。加入樣品溶液（總黃酮濃度0.639mg／ml）后吸附12h，然后用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫，收集70%醇洗脫液6BV。測(cè)定洗脫液的吸光度，計(jì)算總黃酮的量和收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，5種樹(shù)脂中非極性的D－101樹(shù)脂在總黃酮的量和收率方面效果最好，因此，選用D－101作為實(shí)驗(yàn)優(yōu)選樹(shù)脂［9］。

3.4 大孔樹(shù)脂洗脫溶劑的初步考察

精密量取供試品溶液適量（約相當(dāng)于2.0g浸膏），以水洗至流出液近無(wú)色（6BV）后置于預(yù)先以水為溶劑填裝的大孔吸附樹(shù)脂柱上部，依次用體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、45%、60%、75%、85%、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液6BV，測(cè)定洗脫液中固形物量和總黃酮量，計(jì)算黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和收率。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為15%～60%乙醇洗脫部分，總黃酮收率已經(jīng)達(dá)到65.72%，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇并沒(méi)有明顯增加總黃酮的收率。

表3 大孔樹(shù)脂不同洗脫溶劑對(duì)總黃酮的洗脫效果

3.5 聚酰胺與大孔樹(shù)脂連用最佳洗脫溶劑的考察

用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗脫聚酰胺，能使黃酮的解析量達(dá)到33.01mg，解析率達(dá)到87.5%，而D－101大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)解吸附效果顯示體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇就能使總黃酮收率已經(jīng)達(dá)到65.72%，因此有必要進(jìn)一步篩選洗脫溶劑的濃度。精密量取供試品溶液3份，分別拌入等量干燥聚酰胺粉末中，揮去溶劑后，置于3個(gè)小滲漉筒中，用水洗至流出液近無(wú)色（6BV）后分別置于以乙醇為填裝溶劑的D－101大孔吸附樹(shù)脂柱上部，分別用體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%乙醇洗脫，收集洗脫液各6BV，測(cè)定洗脫液中固形物量和總黃酮量，計(jì)算黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和收率。結(jié)果見(jiàn)表4，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇能使總黃酮的收率達(dá)到77.14%，增加洗脫溶劑的濃度反而使黃酮的收率下降，因此選用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作為最佳洗脫濃度。

表4 聚酰胺與大孔樹(shù)脂連用時(shí)不同洗脫溶劑對(duì)總黃酮的洗脫效果

3.6 正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交試驗(yàn)根據(jù)黃酮理化性質(zhì)和大孔樹(shù)脂洗脫特性，考察了上樣藥液浸膏－聚酰胺比例（A）、洗脫液收集量（B）、浸膏－大孔樹(shù)脂比例（C）3個(gè)因素，進(jìn)一步設(shè)置3水平，進(jìn)一步優(yōu)化篩選。測(cè)定洗脫液總黃酮的量，計(jì)算其總黃酮純度和收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，這三種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小順序?yàn)锳＞B＞C，最佳純化工藝條件為A3B2C1，即上樣浸膏－聚酰胺比例1∶3，浸膏－大孔樹(shù)脂比1∶10，收集洗脫液6BV。通過(guò)方差分析，浸膏－聚酰胺、浸膏－大孔樹(shù)脂的比值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響，而洗脫溶劑用量則無(wú)顯著影響。

總黃酮純度＝洗脫液中總黃酮量／洗脫液固形物量

總黃酮收率＝洗脫液中總黃酮量／上柱前藥液中總黃酮量

表5 三因素水平設(shè)置

表6 正交試驗(yàn)篩選結(jié)果

表7 方差分析

3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳純化工藝重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，結(jié)果3 批樣品總黃酮收率為（86.76±2.3）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（55.27±3.6）%。結(jié)果表明，聚酰胺.大孔樹(shù)脂聯(lián)用分離純化杜仲雄花總黃酮的工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié)果與討論

4.1 結(jié)果

聚酰胺與D－101 樹(shù)脂聯(lián)合應(yīng)用能很好的富集杜仲雄花總黃酮。最佳工藝條件為浸膏與聚酰胺比為1∶3，浸膏與大孔樹(shù)脂比為1∶10，以體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫，收集洗脫液6BV。富集物總黃酮收率可達(dá)86.76%%，黃酮純度為55.27%。該方法優(yōu)于目前常用黃酮富集，且工藝簡(jiǎn)單，樹(shù)脂再生容易，具有良好的運(yùn)用前景。

4.2 討論

聚酰胺、大孔吸附樹(shù)脂是分離黃酮類物質(zhì)的常用材料，由于其吸附機(jī)制不同，兩者在分離純化中各有優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將聚酰胺與大孔吸附樹(shù)脂聯(lián)用可充分發(fā)揮兩者優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)不足。本實(shí)驗(yàn)選擇以聚酰胺作吸附劑，一方面，經(jīng)水洗可除去大部分水溶性雜質(zhì)，另一方面，聚酰胺對(duì)色素及部分脂溶性成分仍保持較好的截留，減輕了對(duì)大孔樹(shù)脂柱的污染和負(fù)擔(dān)。經(jīng)初步分級(jí)的上柱液再經(jīng)大孔樹(shù)脂純化，再利用樹(shù)脂吸附和分子篩作用即可極大地提高產(chǎn)物的純度。這種方法操作簡(jiǎn)單，柱再生方便，黃酮富集率高，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

［1］肖攻，曹玉華，劉彪.蘆薈汁天然飲料工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（1）：271－274.

［2］董娟娥，梁宗鎖，張康健，等.杜仲雄花中次生代謝物合成積累的動(dòng)態(tài)變化［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2005，14（4）：7－10.

［3］郭勝偉，王天山，蔡寶昌，等.蘆薈飲料的開(kāi)發(fā)研究［J］食品科學(xué)，2002，23（11）：76－78.

［4］肖靜，李三華，莫寧萍，等.杜仲總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，（3）：26.

［5］杜鵬，肖潤(rùn)梅，陳勇.淫羊藿總黃酮、杜仲總黃酮對(duì)維甲酸所致小鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］.《湖北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版》2005，30（4），392－394.

［6］劉鄂湖，鄢丹，蔡光明，等.大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)在中藥中應(yīng)用現(xiàn)存問(wèn)題分析與探討［J］.中草藥，2007，38（5）：附3－附5.

［7］劉志祥.大孔樹(shù)脂在純化杜仲總黃酮中的應(yīng)用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1468－1470.

［8］張蕾，廖瓊峰，謝智勇，馮志強(qiáng)，曾元兒.聚酰胺－大孔樹(shù)脂聯(lián)用富集苦參總黃酮［J］.中草藥，200833（3）：264－268.

［9］黃松，丁婕，陶艷，羅明琍，賴小平.聚酰胺樹(shù)脂精制甜茶總黃酮的工藝研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，20103（21）：311－313.