胡新德，張 偉，劉笙腩，李玲玲，宋玲珍，柴學軍，陳樹林，趙善廷＊

（1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100；2.德國弗萊堡大學醫(yī)學院解剖研究所，弗萊堡79104）

絲切蛋白（cofilin）是一種存在于真核細胞生物中的小分子（19ku）肌動蛋白分子結合蛋白，它通過對肌動蛋白的解聚作用使G-actin能被循環(huán)使用，從而保證F-actin能快速解聚和聚合，引起細胞肌動蛋白骨架重組，促進細胞運動和遷移［1-4］。在F-actin尾端切割卸載G-actin的能力和活性受絲切蛋白N末端第3位點絲氨酸（serine 3，Ser3）磷酸化狀態(tài)的調控。當Ser3處于非磷酸化狀態(tài)時，絲切蛋白具有切割F-actin的活性，而當Ser3被磷酸化時，絲切蛋白則失去切割F-actin的能力，因此，絲切蛋白Ser3位點的磷酸化／去磷酸化狀態(tài)在F-actin的解聚和聚合方面起著開關的作用［5-8］。而絲切蛋白的磷酸化狀態(tài)直接受LIMK（LIM kinase）和TESK（testisspecific protein kinase）家族蛋白激酶的調控，LIMK家族包括LIMK1和LIMK2，是神經(jīng)系統(tǒng)中絲切蛋白的主要蛋白激酶，通過調節(jié)絲切蛋白的活性調節(jié)發(fā)育過程中actin的活動，而TESK 家族蛋白激酶則主要是在生殖系統(tǒng)中表達［9-11］。而去磷酸化狀態(tài)主要 受SSH（slingshot）家 族（SSH1、SSH2 和SSH3）和CIN（chronophin）的調控。SSH 廣泛分布在哺乳動物的各種組織中，CIN 磷酸酶則主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，是神經(jīng)系統(tǒng)中絲切蛋白的主要去磷酸化酶［12-13］。

目前，研究表明絲切蛋白與神經(jīng)元的突觸可塑性，與學習和記憶，先天無腦回畸形，癲癇以及神經(jīng)分裂癥等密切相關［14-15］。在海馬發(fā)育過程中，諸多因素通過調節(jié)絲切蛋白的Ser3磷酸化狀態(tài)從而調節(jié)神經(jīng)元的遷移，纖維聯(lián)系的建立以及突觸的形成等過程［16］。然而在海馬發(fā)育過程中絲切蛋白以及其磷酸化狀態(tài)調節(jié)基因的表達量變化模式目前尚無系統(tǒng)研究。本研究通過提取不同時期小鼠海馬組織總RNA，以GAPDH 為內參通過半定量PCR 系統(tǒng)研究了海馬發(fā)育不同時期絲切蛋白的表達量變化趨勢以及絲切蛋白磷酸化和去磷酸化基因的表達量變化趨勢，為進一步研究絲切蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的功能及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的活性調節(jié)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆系健康小鼠購自西安交通大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于西北農林科技大學超凈鼠房，在3月齡左右交配，交配成功后孕鼠單獨飼養(yǎng)至小鼠出生。將小鼠出生時記為P0（postnatal 0 day），并將出生后的小鼠分為5組，每組3只，分別飼養(yǎng)至不同的年齡，即P0，P7，P14，P28，P60。

1.1.2 主要試劑及儀器設備 Trizol及總RNA提取相關試劑購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；2×TaqPCR StarMix購自GeneStar；DEPC 原液，Sigma公司產(chǎn)品分裝；瓊脂糖購自HydraGene 公司；高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；Mycycle型PCR 儀購自Bio-Rad公司；超微量分光光度計購自日本島津公司；ChampChemi型凝膠成像分析系統(tǒng)購自北京賽智公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 引物設計 利用Primer premier 5.0軟件，根據(jù)NCBI上公布的基因序列跨內含子設計PCR 引物，同時以GAPDH 為內參，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR用引物Table 1 The of primers for PCR

1.2.2 海馬剝離、總RNA 提取及反轉錄 將不同時期（P0、P7、P14、P28、P60）的小鼠斷頸處死，小心取出腦組織，用解剖刀剝離海馬，立即放入液氮中研磨至無可見顆粒為止，將粉末轉移至DEPC 處理的新離心管內，按照Invitrogen 公司RNA 提取試劑盒上的說明書操作步驟提取組織樣品總RNA，經(jīng)超微量分光光度計測定RNA 濃度后，保存于-80 ℃冰箱備用。取不同時期的小鼠海馬組織總RNA 各2.5μg進行反轉錄。反轉錄體系為：總RNA 2.5μg，5×Reaction buffer 4μL，Oligo（dT）2μL，10 mmol／L dNTPs 1μL，RNase Inhibitor 1μL，RT-Enzmye 1μL，用DEPC水補足20μL體系。42 ℃反應1h，70 ℃5min滅活，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 半定量PCR 擴增 取1μL 不同時期海馬組織反轉錄產(chǎn)物，稀釋后用超微量分光光度計測定cDNA 濃度，以GAPDH為內參，調整cDNA 模 板加入量，將內參基本調節(jié)一致后按照調整后的模板加入量擴增不同的基因片段。PCR 體系：2×TaqPCR StarMix 10μL，F(xiàn)-Primer 0.75μL，R-Primer 0.75μL，cDNA xμL，用ddH2O 補足20μL 體系。PCR反應程序參數(shù)：95℃5min，95℃30s，Tm（表1）30s，72℃30s，30 個循環(huán)。反應結束后，取15μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L凝膠電泳分析。

1.2.4 圖片及數(shù)據(jù)分析 圖片通過Image J軟件分析各條帶灰度值，將電泳條帶亮度轉換為數(shù)值，通過內參GAPDH 對樣品進行標準化，將各基因PCR灰度值／GAPDH 灰度值得到一個相對比值ω。將同一基因在海馬發(fā)育的不同時期的ω值作圖分析，得到不同基因在海馬發(fā)育的不同時期的表達量變化趨勢。

2 結果

2.1 小鼠海馬發(fā)育不同時期絲切蛋白表達量變化

從圖1可以看出，在小鼠海馬發(fā)育不同時期絲切蛋白表達量整體都很高，在P0 時期絲切蛋白的表達量最高，而且在P0～P7這段時間內其表達基本穩(wěn)定不變。隨著海馬的發(fā)育成熟絲切蛋白的表達量逐漸降低，但結果顯示其表達量在不同發(fā)育時期變化并不大，P0時期絲切蛋白的表達量約為P60時期的1.37倍（n＝3）。

2.2 小鼠海馬發(fā)育不同時期絲切蛋白磷酸化基因表達量變化

LIMK 是神經(jīng)系統(tǒng)中絲切蛋白的主要激酶，能使絲切蛋白磷酸化從而調節(jié)其活性。在小鼠海馬發(fā)育過程中絲切蛋白的表達量變化并不大，但如圖2所示，LIMK 表達量變化卻極為顯著，在P0 時期LIMK1的表達量明顯高于P60時期，從P0到P14 LIMK1表達量顯著下降，P0時期LIMK1的表達量是P14 時 期 的5.05 倍（n＝3），而P14 到P60 LIMK1的表達量僅略微下降，P14時期LIMK1表達量為P60時期LIMK1表達量的1.75倍（n＝3）。TESK1在海馬中幾乎無表達，而LIMK2和TESK2的表達量則基本維持不變。

2.3 小鼠海馬發(fā)育不同時期絲切蛋白去磷酸化基因表達量變化

從圖3中可以看出，在小鼠海馬發(fā)育的不同時期絲切蛋白去磷酸化基因的表達量變化也很明顯，在神經(jīng)系統(tǒng)中CIN 是絲切蛋白的主要去磷酸化基因，其表達量從P0 到P60 逐漸升高，在P60 時期CIN 的表達量約是P0時期CIN 表達量的2.88倍（n＝3）。在神經(jīng)系統(tǒng)中SSH 蛋白家族對絲切蛋白的去磷酸同樣發(fā)揮很重要的作用，其中SSH3表達量的變化最為明顯，P7 時期SSH3 的表達量約是P0時期的7.4倍（n＝3），而到P14時期SSH3的表達量約是P0時期的26.5倍（n＝3）。SSH 蛋白家族中的SSH1和SSH2在這個過程中的表達量變化不明顯。

圖1 小鼠海馬不同發(fā)育時期絲切蛋白表達量變化Fig.1 The expression changes of cofilin in different development stages of mouse hippocampus

圖2 小鼠海馬不同發(fā)育時期絲切蛋白磷酸化基因表達量變化Fig.2 The expression changes of cofilin phosphorylation genes in different development stages of mouse hippocampus

圖3 小鼠海馬不同發(fā)育時期絲切蛋白去磷酸化基因表達量的變化Fig.3 The expression changes of cofilin dephosphorylation genes in different development stages of mouse hippocampus

3 討論

微絲的動態(tài)穩(wěn)定性調節(jié)與小鼠海馬發(fā)育過程中細胞分裂，神經(jīng)元遷移，樹突和軸突的生長以及突觸的形成等過程密切相關。在小鼠海馬發(fā)育過程中，P0～P7主要發(fā)生的是細胞的分裂增殖和神經(jīng)元遷移；P7～P14細胞開始長出大量的突起，開始建立細胞間的突觸聯(lián)系；P14之后主要是神經(jīng)元間建立突觸聯(lián)系以及學習記憶功能的完善過程。絲切蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的肌動蛋白解聚因子，調節(jié)微絲的動態(tài)穩(wěn)定性，參與細胞分裂，神經(jīng)元遷移，樹突和軸突的生長以及突觸的形成等生命活動［17］。本研究結果顯示在小鼠海馬發(fā)育整個過程中絲切蛋白一直處于高表達狀態(tài)，隨著海馬的發(fā)育成熟其表達量只是略微降低，說明絲切蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及功能維持中有重要的作用。然而，絲切蛋白磷酸化和去磷酸化基因在這個過程中的表達量差異卻很大。從P0到P14時期，LIMK1的表達量顯著下降，而從P14到P60LIMK1 的表達量僅略微下降，而且LIMK2的表達量變化不明顯。這可能是因為LIMK1是海馬發(fā)育過程中絲切蛋白的主要激酶，機體主要通過調節(jié)LIMK1來實現(xiàn)對絲切蛋白局部磷酸化的調節(jié)，P0到P14時期是其表達量迅速變化的時期而此時也正是海馬快速發(fā)育的時期。有研究表明，LIMK2在神經(jīng)系統(tǒng)的中的表達量明顯低于LIMK1，LIMK1 是神經(jīng)系統(tǒng)中ADF／絲切蛋白的主要激酶［18］，本試驗結果也從另一個角度證實了這一點。P0到P7時期較高水平的LIMK1和低表達水平的CIN／SSH3 將導致較高水平的p-cofilin，這可能與細胞分裂增殖和神經(jīng)元遷移過程中保持微絲的動態(tài)穩(wěn)定性有關。在P14到P60時期，絲切蛋白 的表達量略微降低，但CIN／SSH3的表達量很高而LIMK1 的表達量則維持在一個較低的水平。CIN 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的絲切蛋白磷酸酶，對絲切蛋白的局部活性調節(jié)有至關重要的作用［15］。CIN／SSH3表達量的上升以及LIMK 表的量的降低將導致絲切蛋白的活性增高，在這個時期絲切蛋白的總量是降低的，而它的活性的增高可能與海馬神經(jīng)元間纖維聯(lián)系的建立以及突觸的形成等需要精細調控的過程密切相關。

在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中LIMK 本身也受上游信號分子的調控，經(jīng)典途徑是RhoGTPase／ROCK／LIMK／cofilin／ADF信號通路［19］，而CIN／SSH 家族蛋白本身的調控目前尚不清楚。本研究從轉錄水平研究了海馬發(fā)育過程中絲切蛋白的表達情況，表明在小鼠海馬發(fā)育過程中機體不但在翻譯后修飾水平對絲切蛋白進行調控，而且在轉錄水平對絲切蛋白進行調控，但具體機制尚不清楚。同時，本研究還從轉錄水平研究了絲切蛋白活性調節(jié)基因的表達，表明在小鼠海馬發(fā)育過程中除了經(jīng)典的RhoGTPase／ROCK／LIMK／cofilin 途徑調節(jié)微絲的動態(tài)穩(wěn)定性外，還存在某種未知機制通過調節(jié)LIMK、CIN、SSH 家族蛋白的表達來調節(jié)絲切蛋白的活性，從而實現(xiàn)復雜的生命活動調控。

本文從轉錄水平研究了海馬發(fā)育過程中絲切蛋白及其磷酸化與去磷酸化基因的表達水平，從另一個角度闡明了海馬發(fā)育過程中絲切蛋白對微絲的動態(tài)穩(wěn)定性調節(jié)，為闡明絲切蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用及其活性調節(jié)提供了一個新的思路。

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