陳 浩，許 浪

（1.湖北省荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434100；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖北 武漢 430065）

Nrf2／NQO1信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制

陳 浩1，許 浪2

（1.湖北省荊州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 荊州 434100；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖北 武漢 430065）

目的：觀察核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、醌氧化還原酶（NQO1）在胃癌干細(xì)胞和正常胃黏膜組織中的表達(dá)，探討Nrf2／NQO1信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制。方法：采用腫瘤球懸浮分選法從60例胃癌組織標(biāo)本中分選胃癌干細(xì)胞，干細(xì)胞隨機(jī)分為干細(xì)胞初分組和激活組。30例正常胃黏膜組織作為對(duì)照。采用Western blotting法檢測(cè)各組Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)水平和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，干細(xì)胞初分組和激活組Nrf2、NQO1的表達(dá)水平升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低，MDA活性則顯著升高（P＜0.05）；與干細(xì)胞初分組比較，激活組Nrf2、NQO1的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA活性顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：激活Nrf2／NQO1通路可以調(diào)節(jié)胃黏膜組織中SOD和MDA的活性，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。

Nrf2／NQO1信號(hào)通路；氧化應(yīng)激；胃癌干細(xì)胞；超氧化物歧化酶；丙二醛

胃癌是消化系常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。國(guó)外研究［1］表明：腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后也起到?jīng)Q定性作用。研究［2］表明：胃癌發(fā)生部位與胃癌干細(xì)胞定居部位一致，且具有許多共同特性，提示胃癌可能是一種干細(xì)胞疾病。無(wú)論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞都趨于維持還原穩(wěn)態(tài)以保證自身的生長(zhǎng)和增殖，而調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2）在這種穩(wěn)態(tài)的維持中起關(guān)鍵作用。研究［3］表明：Nrf2可保護(hù)肺臟、肝臟、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多種器官或組織。醌氧化還原酶（NADPH quinine oxidoreductase，NQO1）是Nrf2的下游抗氧化酶基因，與內(nèi)源或外源物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。本研究通過(guò)觀察胃癌干細(xì)胞組織Nrf2／NQO1信號(hào)通路中Nrf2、NQO1的表達(dá)及其二相解毒酶基因超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）活性變化，探討該信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例標(biāo)本組織來(lái)源于2008年3月—2011年10月本院行胃腸外科手術(shù)切除且經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃癌的標(biāo)本，其中男性35例，女性25例，年齡38～75歲，平均年齡（51.6±2.4）歲。依據(jù) WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)由本院病理科進(jìn)行病理診斷。30例正常胃黏膜組織來(lái)自2007年8月—2011年5月本院胃鏡室活檢標(biāo)本，其中男性18例，女性12例，年齡40～73歲，平均年齡（53.1±2.6）歲。標(biāo)本取出后均立即經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后封存。所有患者材料均經(jīng)家屬同意，并有知情同意書(shū)。獲本院道德及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、標(biāo)準(zhǔn)FBS和EDTA由北京中杉金橋公司提供；胰蛋白酶、新生牛血清、40μm篩網(wǎng)均由武漢御和生物有限公司提供；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和CD44鼠抗人單克隆抗體均由德國(guó)Merck公司提供；Nrf2、NQO1和兔多克隆抗體由上海研晶生物試劑有限公司提供；姜黃素由美國(guó)Gibco公司提供；Western blotting顯色劑由法國(guó)Pierce公司提供；SOD、MDA檢測(cè)試劑盒由南京建成生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 胃癌干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、分化及鑒定 無(wú)菌條件下取腫瘤標(biāo)本，常規(guī)二甲苯脫蠟梯度酒精至水洗，剔除血管和壞死組織，以PBS沖洗后，無(wú)血清1640培養(yǎng)液中銳性分離，以0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清終止消化，篩網(wǎng)過(guò)濾。離心后去上清，以含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，次日換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)傳代、培養(yǎng)。收集胃癌懸浮細(xì)胞并充分混懸，加入CD44＋抗體包被的超微磁珠混勻，安裝分離柱至磁場(chǎng)，以2mL緩沖液沖出陽(yáng)性結(jié)合細(xì)胞，離 心 接 種 到 含 EGF（20×10－12g·L－1）、bFGF（20×10－12g·L－1）、LIF（10×10－12g·L－1）和b27（1×）的無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中克隆球細(xì)胞貼壁分化增殖，將CD44＋標(biāo)記為胃癌干細(xì)胞，對(duì)克隆球細(xì)胞行免疫熒光染色鑒定，染色陽(yáng)性即為胃癌干細(xì)胞，將分離的干細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將分離所得的胃癌干細(xì)胞懸液隨機(jī)均分成干細(xì)胞初分組（胃癌干細(xì)胞懸液加入營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)）和激活組［胃癌干細(xì)胞懸液加入50μmol·L－1姜黃素（Nrf2激活劑）激活 Nrf2通路，繼續(xù)培養(yǎng)］。正常胃黏膜組織置于勻漿器中手工勻漿，制備10%正常胃黏膜組織勻漿，離心，取上清液，制備正常胃黏膜組織細(xì)胞懸液，加入營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，作為正常對(duì)照組。

1.5 Western blotting法檢測(cè)Nrf2和NQO1蛋白的表達(dá)水平 取上述各組細(xì)胞懸液加入裂解液提取蛋白，將提取的樣本蛋白變性后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1h，然后將PVDF膜浸沒(méi)在Nrf2抗體（1∶500）、NQO1抗體（1∶500）溶液中，置于4℃冰箱中過(guò)夜，次日再將PVDF膜沖洗后浸沒(méi)在兔多克隆抗體（1∶1 000）溶液中，室溫孵育2h，采用BCL顯色法檢測(cè)PVDF膜上蛋白表達(dá)水平。1.6 SOD和MDA活性檢測(cè) 取各組細(xì)胞懸液，2 000r·min－1離心15min，取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD和MDA活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Nrf2、NQO1表達(dá)水平和SOD、MDA活性以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Nrf2和NQO1蛋白在胃癌干細(xì)胞及正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平 干細(xì)胞初分組及激活組Nrf2和NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），干細(xì)胞激活組Nrf2和NQO1蛋白表達(dá)水平高于干細(xì)胞初分組（P＜0.01）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組Nrf2和NQO1蛋白的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of Nrf2and NQO1proteins in various groups ［n＝30，±s，ρB／（mg·L－1）］

表1 各組Nrf2和NQO1蛋白的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of Nrf2and NQO1proteins in various groups ［n＝30，±s，ρB／（mg·L－1）］

＊P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.01 vs stem cells early group.

Group Nrf2 NQO1 Normal control 24.35±7.12 21.27±5.38 Stem cells early 41.09±5.31＊ 39.06±3.32＊Activiated 98.43±20.55＊△ 87.15±31.74＊△

圖1 Nrf2和NQO1蛋白在各組胃癌干細(xì)胞及正常胃黏膜組織中表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of Nrf2and NQO1 proteins in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue in various groups

2.2 SOD和MDA在胃癌干細(xì)胞及正常胃黏膜組織的活性 干細(xì)胞初分組SOD活性顯著低于正常對(duì)照組 （P＜0.05），經(jīng)姜黃素激活后，SOD活性顯著增強(qiáng) （P＜0.05），與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；干細(xì)胞初分組 MDA活性顯著高于正常對(duì)照組 （P＜0.05），但激活組MDA活性顯著降低 （P＜0.05），與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 SOD和MDA在胃癌干細(xì)胞及正常胃黏膜組織中的活性Tab.2 Activities of SOD and MDA in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue （n＝30，±s）

表2 SOD和MDA在胃癌干細(xì)胞及正常胃黏膜組織中的活性Tab.2 Activities of SOD and MDA in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue （n＝30，±s）

.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.01 vs stem cells early group.

Group SOD activity（U·mg－1 prot）MDA activity［cB／（μmol·L－1］Normal control 123.84±4.16 1.34±0.66 Stem cells early 73.82±2.07＊＊ 3.17±0.25＊Activiated 118.72±4.25△ 1.41±0.79△

3 討 論

腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中持續(xù)經(jīng)歷著各種應(yīng)激因素，使機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性應(yīng)答反應(yīng)即氧化應(yīng)激，輕度氧化應(yīng)激往往引起促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、分化等適應(yīng)性變化，重度氧化應(yīng)激則造成細(xì)胞增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等損傷性變化［4］。氧化應(yīng)激導(dǎo)致抗氧化類物質(zhì)隨之升高，破壞了機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，致使組織細(xì)胞中自由基產(chǎn)生增多，從而導(dǎo)致了包括腫瘤在內(nèi)的一些疾病的發(fā)生［5］。因此氧自由基及其促氧自由基生成的相關(guān)酶類的增加在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著一定作用［6－7］。MDA活性高低可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，而SOD的活性度則反映了細(xì)胞內(nèi)主要抗氧化能力［8］。有文獻(xiàn)［9］報(bào)道：癌癥患者血漿中SOD的活性較健康人降低。涂宏蕾等［10］研究顯示：胃癌患者血漿中 MDA表達(dá)水平明顯升高。Nrf2是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1偶聯(lián)，錨合于胞質(zhì)，處于活性相對(duì)抑制狀態(tài)。在細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)或有其他親核劑信號(hào)刺激時(shí)，Nrf2可與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，從而被激活轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)下游抗氧化酶基因NQO1的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)：抑制 Nrf2向細(xì)胞核易位會(huì)加重氧化應(yīng)激，導(dǎo)致非諾貝特介導(dǎo)的肝癌的形成。Nrf2缺陷鼠比野生鼠更易形成肺轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)［13］。Nrf2激活劑——人工合成的咪唑啉三萜系衍生物能在肝、肺、腎、腸、腦、心臟、胸腺和唾液腺中，通過(guò)提高NQO1表達(dá)而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用［14］。萊菔硫烷、姜黃素和奧替普拉等化合物均可誘導(dǎo)Nrf2下游基因NQO1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）和γ－谷氨酰半胱氨酸酶催化亞單位（GCLC）等基因表達(dá)，進(jìn)而對(duì)幽門(mén)螺桿菌引起胃癌起到化學(xué)保護(hù)作用，減少腫瘤形成［15］。在缺血再灌注模型中，Nrf2激活劑CDDO－Me可以顯著增加抗氧化劑基因的表達(dá)［16］。

本研究結(jié)果顯示：Nrf2和NQO1蛋白在胃癌干細(xì)胞初分組中的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，提示由于胃癌發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，胃癌干細(xì)胞內(nèi)Nrf2被激活，上調(diào)下游基因NQO1的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用；但與正常對(duì)照組比較，干細(xì)胞初分組的SOD的活性顯著降低，MDA異常升高，說(shuō)明胃癌干細(xì)胞的SOD活性降低，產(chǎn)生了大量MDA，NQO1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用不足以對(duì)抗該嚴(yán)重的過(guò)氧化損傷。而經(jīng)過(guò)Nrf2激活劑姜黃素干預(yù)胃癌干細(xì)胞后，Nrf2和NQO1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)干細(xì)胞激活組SOD的活性顯著增強(qiáng)，MDA顯著下降，減輕了干細(xì)胞的氧化損傷。由此推測(cè)，Nrf2／NQO1信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，激活該通路，可以誘導(dǎo)Nrf2的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NQO1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性，起到保護(hù)細(xì)胞的作用。本研究結(jié)果為胃癌的干細(xì)胞治療提供了新思路。

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Mechanism of Nrf2／NQO1signal pathway in oxidative stress of gastric cancer stem cells

CHEN Hao1，XU Lang2
（1.Department of Gastrointestinal Surgery，Central Hospital，Jingzhou City，Hubei Province，Jingzhou 434100，China；2.Department of Pathology，School of Medical Science，University of Science and Technology，Wuhan 430065，China）

Objective To observe the expressions of nuclear factor E2－related factor 2（Nrf2）and NADPH quinine oxidoreductase（NQO1）in gastric cancer stem cells and normal gastric mucosa tissue，and to investigate the mechanism of Nrf2／NQO1signal pathway in oxidative stress of gastric cancer stem cells.Methods Tumor spheroids suspended separation method was used to select stem cells in 60gastric cancer tissue specimens.The stem cells were randomly divided into stem cells early group and activiated group.30cases of normal gastric mucosa tissues were regarded as normal control group.Western blotting method was applied to detect the expressions of Nrf2and NQO1protein in various groups.The activities of superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）were observed.Results Compared with normal control group，the expression levels of Nrf2and NQO1in stem cells early group and activated group were increased（P＜0.05），and the activity of SOD was decreased while the activity of MDA was increased significantly（P＜0.05）.Compared with stem cells early group，the expression levels of Nrf2and NQO1in activated group were remarkably increased（P＜0.05），and the activity of SOD was increased while the activity of MDA was decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion Activating Nrf2／NQO1 signal pathway can adjust the activities of SOD and MDA in gastric mucosa tissue to enhance the tolerance of gastric mucosal cells against oxidative stress in order to protect the cells.

Nrf2／NQO1signal pathway；oxidative stress；gastric cancer stem cells；superoxide dismutase；malondialdehyde

R318.04

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0463－04

10.7694／jldxyxb20130308

2012－12－30

國(guó)家 “973”項(xiàng)目資助課題 （2011CB964700－G）

陳 浩 （1980－），男，湖北省仙桃市人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事胃腸外科的基礎(chǔ)與臨床研究。

許 浪 （Tel：027－68893395，E－mail：643025＠qq.com）