陳煒,白永安,李曉東,趙文

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司,遼寧盤(pán)錦124200)

春夏季遼寧盤(pán)錦地區(qū)土池培養(yǎng)的小球藻總脂肪含量和脂肪酸的組成分析

陳煒1,白永安2,李曉東2,趙文1

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023;2.盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司,遼寧盤(pán)錦124200)

研究了2008—2010年春夏季(3—8月)遼寧省盤(pán)錦地區(qū)小球藻Chlorella pyrenoidesa體內(nèi)總脂肪含量和脂肪酸組成的變化規(guī)律。結(jié)果表明:春季(4—6月)采集的小球藻粗脂肪含量顯著高于初春(3月)和夏季(7、8月);采集的小球藻脂肪酸中多不飽和脂肪酸(PUFA)含量,3—5月逐漸上升,6—8月顯著下降(P＜0.05),其中4、5月PUFA含量均較高,約占總脂肪酸的51%,主要是二十碳五烯酸(EPA)的含量增加;小球藻脂肪酸中飽和脂肪酸(SFA)含量的變化規(guī)律與PUFA相反,單不飽和脂肪酸(MUFA)含量的波動(dòng)較小。研究表明,4—5月是盤(pán)錦地區(qū)室外土池培養(yǎng)小球藻的最佳收獲期。

小球藻;脂肪;脂肪酸

小球藻Chlorella pyrenoidesa是魚(yú)、蝦、雙殼類(lèi)等多種養(yǎng)殖動(dòng)物幼體重要的天然餌料。小球藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于自身多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量。小球藻的脂肪含量和脂肪酸組成與環(huán)境因子(光照、溫度、鹽度、pH等)密切相關(guān)[1-2],因此,室外培養(yǎng)的小球藻,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值會(huì)隨季節(jié)的變化而變化。

盤(pán)錦遼河三角洲地區(qū)具有自然條件的優(yōu)勢(shì),生產(chǎn)中常采用室外土池來(lái)大規(guī)模培養(yǎng)小球藻。雖然室外培養(yǎng)小球藻的技術(shù)比較成熟,但與室內(nèi)培養(yǎng)相比,受環(huán)境因子的影響較大。為了定量分析池塘培養(yǎng)的小球藻的營(yíng)養(yǎng)組成,筆者連續(xù)3年采集了該地區(qū)春夏季的小球藻樣本,研究了室外土池培養(yǎng)小球藻體內(nèi)總脂肪含量和脂肪酸組成的季節(jié)變化規(guī)律,以期為盤(pán)錦地區(qū)在室外土池培養(yǎng)高質(zhì)量小球藻提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidesa采自盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司三角洲養(yǎng)殖場(chǎng)的池塘,采樣時(shí)間為2008—2010年每年3—8月。培養(yǎng)池為戶(hù)外土池(長(zhǎng)×寬為15 m×5 m),水深約40 cm。土池中小球藻為單種培養(yǎng),并根據(jù)水色和經(jīng)驗(yàn)適時(shí)進(jìn)水和施肥,在生長(zhǎng)旺季每隔2～3 d施以無(wú)機(jī)肥[w(碳酸氫銨)∶w(過(guò)磷酸鈣)=10∶1]或糞肥(20～50 g/m3),全池均勻潑灑。試驗(yàn)期間水溫,3月為2～5℃,4月為5～15℃,5月為15～22℃,6月為20～24℃,7月為24～26℃,8月為25～29℃(不同年份略有差異);鹽度為15～30。定期測(cè)定藻細(xì)胞密度,一般在小球藻進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期后采收,藻細(xì)胞密度為1 000×104～2 000×104cell/mL。新鮮藻液經(jīng)GF-105型管式高速分離機(jī)(16 000 r/min)離心,藻膏于-24℃下保存待測(cè)。

1.2 方法

粗脂肪的提取方法和脂肪酸甲酯的制備參照文獻(xiàn)[3]中的方法。

用日本島津GC-2010型氣相色譜儀分析脂肪酸。色譜條件:色譜柱為FFAP抗氧化交聯(lián)石英毛細(xì)管柱(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所產(chǎn)品),規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.3 μm;進(jìn)樣口溫度為260℃,分流比為100∶1;載氣為高純N2,柱流量為1 mL/min,柱溫由160℃以2℃/min的速度升至230℃,保持至出峰完畢;FID檢測(cè)器,溫度為230℃。色譜峰的鑒定采用部分脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品(SIGMA公司和上海試劑一廠產(chǎn)品)與ECL值相結(jié)合的方法[4-6],采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 小球藻粗脂肪的含量

從表1可見(jiàn):4、5、6月采集的小球藻粗脂肪含量顯著高于3、7、8月(P＜0.05);3月小球藻粗脂肪的含量最低,4月突增至最大,5、6月略微降低,7、8月明顯減少。

表1 3—8月小球藻粗脂肪的含量(鮮質(zhì)量)Tab.1 The crude fat content in green algae Chlorella pyrenoidesa from March to August(wet weight) %

2.2 小球藻脂肪酸的組成

從表2可見(jiàn):3—8月小球藻主要脂肪酸種類(lèi)沒(méi)有變化,飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)中含量最高的分別為 C16∶0、C16∶1和 C20∶5n-3(EPA),且其含量隨C16∶0、C16∶1和EPA含量的變化而變化;PUFA和EPA含量在3—5月逐漸升高,6—8月顯著降低(P＜0.05),最高值均出現(xiàn)在4、5月,PUFA和EPA含量約占總脂肪酸的51%和42%,且顯著高于其他月份(P＜0.05);SFA與C16∶0含量的變化規(guī)律為3—5月逐漸降低,6—8月顯著升高(P＜0.05);MUFA與 C16∶1含量在3—8月波動(dòng)較小; n-3/n-6值在3—5月較大(3.90～4.62),在6—8月較小(2.39～3.11)。

表2 3—8月小球藻脂肪酸的組成Tab.2 Fatty acid composition of green alga Chlorella pyrenoidesa from March to August %

3 討論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,多不飽和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物幼體生長(zhǎng)和發(fā)育所必需,也是評(píng)價(jià)小球藻營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)。土池培養(yǎng)的小球藻中EPA含量較高,但未檢測(cè)出DHA,脂肪酸組成與海洋小球藻相似[7-10],而與蔣霞敏等[11]對(duì)小球藻的測(cè)定結(jié)果差異很大。由于早期定名的混淆,將淡水小球藻和海水小球藻都命名為小球藻,但它們并非同一種微藻[7,9,11]。從脂肪酸的特點(diǎn)分析,土池培養(yǎng)的蛋白核小球藻應(yīng)當(dāng)屬于海水小球藻,與蔣霞敏等[11]報(bào)道的小球藻很可能不是同一種。

小球藻脂肪含量和脂肪酸組成與環(huán)境因子密切相關(guān),溫度是重要的影響因素之一。李文權(quán)等[12]研究發(fā)現(xiàn),在12、20、26℃水溫下,小球藻的PUFA和EPA含量均在12℃時(shí)最高;曹春暉等[13]研究表明,在16、22、28℃水溫下,3株小球藻總脂肪含量均在16℃時(shí)最高,EPA含量均在22℃時(shí)最高;Teoh等[14]研究發(fā)現(xiàn),在 4、6、9、14、20、30℃水溫下,從南極分離出的小球藻Chlorella UMACC237的PUFA含量在9℃時(shí)最高,在14℃時(shí)次之,而Chlorella UMACC234的PUFA含量在14℃時(shí)最高,在20、9℃時(shí)次之;樊云真等[15]研究發(fā)現(xiàn),4、12月(水溫為15～18℃)收獲的球等邊金藻Isochrysis galbana的DHA含量明顯高于8月(水溫為28～32℃),認(rèn)為季節(jié)的差異主要由溫度不同所致。上述研究表明,在小球藻正常生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi),低溫有利于脂肪和PUFA的積累。

盤(pán)錦遼河三角洲地區(qū)的池塘一般在3月中旬開(kāi)始解凍,水溫尚未達(dá)到小球藻生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)積累的最適溫度;4—5月,隨著氣溫的回暖,水溫逐漸升高,一般在10～20℃,非常適合小球藻的生長(zhǎng)以及脂肪和PUFA的積累;隨著初夏和盛夏的來(lái)臨, 6—8月水溫上升至20～29℃,脂肪的積累開(kāi)始減少,EPA和PUFA的合成亦受到抑制,故總脂肪含量以及EPA、PUFA的比例也隨之下降?？傊?不同月份小球藻總脂肪和脂肪酸的差異與溫度密切相關(guān),變化規(guī)律與上述研究結(jié)論基本一致。

光照是影響小球藻總脂肪含量和脂肪酸組成的另一個(gè)重要因素。李荷芳等[16?[17]也得出相同結(jié)論,即隨著光照強(qiáng)度(250、1 700、3 000、 6 400、9 900、18 000 lx)的增強(qiáng),小球藻EPA和PUFA的含量下降。曹春暉等[18]對(duì) 3株小球藻Chlorella sp.MACC/C95、MACC/C97、MACC/C102的研究表明:C95的總脂肪含量隨光照強(qiáng)度(3 000、5 000、8 000 lx)的變化不大,C97和C102的總脂肪含量則隨光照強(qiáng)度的升高而明顯升高;C95的EPA含量在中低光照強(qiáng)度下較高,在高光照強(qiáng)度下較低,C97和C102的EPA含量則隨光照強(qiáng)度的增加而明顯降低;3株小球藻的PUFA總量均隨光照強(qiáng)度的增加而降低。

盤(pán)錦的水文資料[19]顯示,盤(pán)錦地區(qū)全年平均日照為2 768.5 h,5月日照時(shí)數(shù)最高(278.5 h), 7月較低(216.8 h),11月最低(195.4 h)。日照百分比冬季高于夏季,其中1月的日照百分比最高(70%),8月最低(56%),主要是受雨季云量增多的影響。3、4、5月的盤(pán)錦地區(qū)光照時(shí)間逐漸增長(zhǎng),雖然光強(qiáng)也在逐漸增強(qiáng),但尚未達(dá)到抑制小球藻PUFA合成的程度,故小球藻的總脂肪含量及EPA、PUFA含量隨之增加。6月以后由初夏漸入盛夏,光照過(guò)強(qiáng),EPA、PUFA的合成受到抑制,故又呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)出當(dāng)?shù)厝照諘r(shí)間和日照強(qiáng)度的綜合影響。

在室外土池培養(yǎng)小球藻的過(guò)程中,除了溫度、光照等主要環(huán)境因素的影響之外,實(shí)際影響因素遠(yuǎn)比室內(nèi)培養(yǎng)復(fù)雜得多。Reitan等[20]認(rèn)為,在微藻生長(zhǎng)過(guò)程中,隨著營(yíng)養(yǎng)限制程度的提高,n-3/n-6值下降。本試驗(yàn)中3—5月小球藻的n-3/n-6值較高,6—8月較低,這說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)限制因素對(duì)小球藻的影響夏季大于春季,此時(shí)期更需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小球藻的生長(zhǎng)及各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo),及時(shí)施肥以保證小球藻的營(yíng)養(yǎng)需求。此外,隨著水溫的升高,池塘中輪蟲(chóng)休眠卵開(kāi)始孵化,輪蟲(chóng)多以小球藻為食,如不加以控制便會(huì)迅速繁殖。這種現(xiàn)象主要出現(xiàn)在5月以后。為了控制輪蟲(chóng)的數(shù)量有時(shí)不得不使用諸如漂白粉、強(qiáng)氯精之類(lèi)的藥物,這些藥物在殺死輪蟲(chóng)的同時(shí),也嚴(yán)重干擾小球藻的正常生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)合成,最終導(dǎo)致夏季小球藻生物量以及總脂肪、PUFA含量的降低。

總之,室外土池培養(yǎng)小球藻的影響因素極其復(fù)雜,綜合考慮,盤(pán)錦地區(qū)春季的小球藻營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高,4—5月是該地區(qū)土池培育的小球藻最佳收獲時(shí)期。

致謝:在試驗(yàn)過(guò)程中,大連海洋大學(xué)李永函教授和雷衍之教授給予了精心指導(dǎo)和熱心幫助,大連海洋大學(xué)2008屆畢業(yè)生王保剛、2009屆畢業(yè)生王秀芬、2010屆畢業(yè)生梁明明參加了部分工作,在此表示衷心感謝!

[1]楊秀霞,于浩,曾曉起.影響微藻脂肪酸組成因素概述[J].海洋湖沼通報(bào),2001(1):76-82.

[2]石娟,潘克厚.不同培養(yǎng)條件對(duì)微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].海洋水產(chǎn)研究,2004,25(6):79-85.

[3]陳煒,王秀芬,白永安,等.濃縮方法及保存條件對(duì)小球藻藻膏脂肪酸的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(1):1-5.

[4]Ackman R G.Analysis of oils and fats[M].London:Elsevies Appl Sci Pub,1986:137-206.

[5]Ackman R G.Simplification of analyses of fatty acids in fish lipids and related lipid samples[J].Acta Med Scand,1987,222:99-103.

[6]Christie W W.Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography:a reappraisal[J].J Chromat, 1988,447:305-314.

[7]李荷芳,周漢秋.海洋微藻脂肪酸組成的比較研究[J].海洋與湖沼,1999,30(1):34-40.

[8]俞建江,李荷芳,周漢秋.10種海洋微藻總脂、中性脂和極性脂的脂肪酸組成[J].水生生物學(xué)報(bào),1999,23(5):481-487.

[9]王大志,彭興躍,李少菁,等.海水小球藻脂肪酸組成研究[J].海洋科學(xué),1999,23(4):86-70.

[10]王明清,遲曉元,秦松,等.海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的測(cè)定[J].中國(guó)油脂,2008,33(11):67-70.

[11]蔣霞敏,鄭亦周.14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(3):243-247.

[12]李文權(quán),李芊,廖啟斌,等.溫度對(duì)四種海洋微藻脂肪酸組成的影響[J].臺(tái)灣海峽,2003,22(1):9-13.

[13]曹春暉,孫世春,麥康森,等.溫度對(duì)四株海洋綠藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].鹽業(yè)與化工,2006,35(3):16-18.

[14]Teoh M L,Chu W L,Marchant H,et al.Influence of culture temperature on the growth,biochemical composition and fatty acid profiles of six Antarctic microalgae[J].Journal of Applied Phycology,2004,16(6):421-430.

[15]樊云真,劉發(fā)義,李荷芳.海洋微藻高度不飽和脂肪酸的研究Ⅱ:環(huán)境因子對(duì)球等邊金藻3011中高度不飽和脂肪酸含量的影響[J].海洋科學(xué)集刊,1998,40:155-160.

[16]李荷芳,周漢秋.光照強(qiáng)度對(duì)海洋微藻脂肪含量及脂肪酸組成影響的研究[J].海洋科學(xué)集刊,2001,43:178-183.

[17]廖啟斌,李芊,李文權(quán),等.光輻射對(duì)海洋微藻脂肪酸含量的效應(yīng)[J].海洋技術(shù),2002,21(1):46-48.

[18]曹春暉,孫世春,麥康森,等.光照強(qiáng)度對(duì)四株海洋綠藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2010,30(9):2347-2353.

[19]Casement.盤(pán)錦水文氣候[EB/OL].[2007-09-24].http:// travel.mipang.com/bible/61834

[20]Reitan K I,Rainuzzo J R,Olsen Y.Effect of nutrient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgae[J].Journal of Phycology,1994,30(6):972-979.

Total lipid content and fatty acid composition in green alga Chlorella pyrenoidesa collected from Panjin in Liaoning Province during spring and summer

CHEN Wei1,BAI Yong-an2,LI Xiao-dong2,ZHAO Wen1
(1.Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Panjin Guanghe Crab Industry Co. Ltd.,Panjin 124200,China)

The total lipid content and the fatty acid composition were investigated in green alga Chlorella pyrenoidesa collected from Panjin in Liaoning province during spring and summer(from March to August during 2008-2010).The results showed that the green alga had significantly higher total lipid content in spring(April,May and June)than the alga collected in early spring(March)and summer(July and August).There was significantly higher percentage of polyunsaturated fatty acid(PUFA)in the green alga from March to May and lower from June to August,the maximum representing≈51%of the total fatty acid levels,predominant eicosapentaenoic acid(EPA),in May and April.The levels of saturated fatty acid(SFA)was decreased gradually from March to May, and significantly increased from May to August.The levels of monounsaturated fatty acid(MUFA)was found to be remained little change from March to August.Therefore,the optimal harvesting period of Chlorella pyrenoidesa from outdoor earthern culture ponds was of spring(April to May).

Chlorella pyrenoidesa;fat;fatty acid

S963

A

2013-04-11

國(guó)家海洋局海洋公益項(xiàng)目(201305005-02);大連海洋大學(xué)與盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司合作科研項(xiàng)目(2012023)

陳煒(1968-),女,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。E-mail:chenwei@dlou.edu.cn

2095-1388(2013)06-0585-04