董秋安劉曉偉

?論 著?

恐懼應(yīng)激大鼠血ACTH、CORT、IL-2、IL-8的含量變化

董秋安1★劉曉偉2

目的探索“恐懼”情緒應(yīng)激對大鼠內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的影響。 方法 根據(jù)Takashi方法建立恐懼應(yīng)激模型，通過放射免疫方法檢測ACTH、CORT、IL-2和IL-8，并與正常組、孤獨(dú)飼養(yǎng)組進(jìn)行對照。結(jié)果各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異（F值分別10.466、13.804；均為P＜0.01）?？謶帜Ｐ徒MACTH、CORT水平高于正常對照組及孤獨(dú)飼養(yǎng)組。 各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異（F=3.489，P=0.049），恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對照組，各組大鼠IL-2未見顯著差異（F=1.355，P=0.280）。結(jié)論恐懼可通過激活HPA軸，升高ACTH、CORT水平這一途徑調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)?？謶謶?yīng)激可提高IL-8水平，對機(jī)體免疫功能有抑制作用。

恐懼；心理應(yīng)激；內(nèi)分泌免疫

近年來，情緒與疾病的關(guān)系成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)歷來重視情志對健康和疾病轉(zhuǎn)歸的影響，其“形神合一”、“恐傷腎”等理論，充分體現(xiàn)了中醫(yī)將自然科學(xué)與社會(huì)科學(xué)、人文科學(xué)高度融合的特色，符合生命科學(xué)發(fā)展的趨勢。因此，尋找中醫(yī)學(xué)七情理論與現(xiàn)代心理應(yīng)激理論的學(xué)科交融點(diǎn)，用現(xiàn)代的科學(xué)方法探索恐懼心理應(yīng)激產(chǎn)生的機(jī)理，對中醫(yī)藥防治心身疾病及七情學(xué)說的研究有著重要的理論價(jià)值和臨床意義。本實(shí)驗(yàn)立足于中醫(yī)七情學(xué)說,參照Takashi[1]方法制作恐懼應(yīng)激大鼠動(dòng)物模型，檢測恐懼心理應(yīng)激后大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、血清皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）及白介素-8（interleukin-8，IL-8）的含量，探討恐懼對內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：粵檢證字2002A041號(hào)）。室溫22～26℃安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。動(dòng)物分組：正常對照組、恐懼模型組、孤獨(dú)飼養(yǎng)組，每組8只。

1.2 模型制作方法

恐懼模型組：大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于不銹鋼籠中（50 cm ×30 cm×20 cm），自由飲食飲水，飼養(yǎng)10天。第11天13：30將大鼠單獨(dú)放入光電刺激儀（30 cm×40 cm ×40 cm），四周為玻璃，底部鋪設(shè)銅柵，通以1 mA交流電，頂部置10 W日光燈；前5 min為適應(yīng)期，后同時(shí)給予電擊和閃光，每次1 s，間隔1 min，共30次。第12，13天重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第14天實(shí)驗(yàn)只予光照，不予電擊，攝像記錄第6 min～30 min內(nèi)大鼠行為變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束立即放入曠場實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測。

孤獨(dú)飼養(yǎng)組：大鼠于同樣環(huán)境下孤獨(dú)飼養(yǎng)10天，第14天13：30攝像記錄大鼠行為變化，并對其行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分，14：00放入曠場實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測。

同樣環(huán)境下，正常對照組大鼠予以群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，第14天進(jìn)行行為學(xué)測定及曠場實(shí)驗(yàn)，步驟及時(shí)間同孤獨(dú)飼養(yǎng)組。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物抓取要求動(dòng)作特別輕柔，避免不必要的刺激干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 主要試劑

ACTH放射免疫試劑盒、CORT放射免疫試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所。IL-2、IL-8放射免疫檢測試劑盒購自北京北免東雅生物技術(shù)研究所。SN695B型放射免疫γ計(jì)數(shù)器（上海日環(huán)廠）、Eppendorff微量加樣器（德國Eppendorff公司）、SONY.DCR-TRV9E數(shù)碼攝像機(jī)（日本索尼公司）。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

實(shí)驗(yàn)第14天，所有動(dòng)物曠場實(shí)驗(yàn)后麻醉，斷頭處死，取血，部分離心制備血清；部分肝素抗凝離心制備血漿，-20℃凍存。方法按照放射免疫試劑盒說明進(jìn)行操作，檢測血漿ACTH水平、血清CORT 、IL-2、 IL-8含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ACTH、CORT比較

各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異（F值分別10.466、13.804；均為P＜0.01）?？謶帜Ｐ徒M血漿ACTH、CORT水平均高于另外兩組（均為P＜0.05）；孤獨(dú)飼養(yǎng)組與正常對照組ACTH、CORT比較，無顯著差異（均為P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠ACTH、CORT水平比較Table 1 Comparison of CORT and ACTH of each group

2.2 各組大鼠IL-2、IL-8比較

各 組 大 鼠IL-2未 見 顯 著 差 異（F=1.355，P=0.280），各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異（F=3.489，P=0.049），恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對照組（P=0.015）。孤獨(dú)飼養(yǎng)組IL-8水平與恐懼模型組及正常對照組相較，均無顯著差異（均為P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清IL-2、IL-8比較Table 2 Comparison of IL-2 and IL-8 in serum of each group

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)的主要特征是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA）的激活為核心的生理反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)恐懼應(yīng)激模型組大鼠的下游激素——血漿ACTH、血清CORT均明顯高于正常組（均為P＜0.01），表明恐懼心理應(yīng)激過程中HPA軸被激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；心理應(yīng)激發(fā)生時(shí)，首先作用于大腦改變腦的內(nèi)分泌機(jī)能，其中最重要的途徑是HPA被激活。ACTH和CORT的含量可以反映垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能變化[2]。下丘腦為間腦前臂，可以接受末端信息，又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，進(jìn)而控制皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，啟動(dòng)HPA軸，影響與應(yīng)激有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動(dòng)[3]。

HPA軸在內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著非常重要的作用，應(yīng)激時(shí)HPA軸被激活。ACTH是控制腎上腺皮質(zhì)激素合成和分泌的重要因素，是垂體分泌的重要激素之一，主要產(chǎn)生于垂體前葉，其合成與分泌對下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)控具有重要的意義，可反映出HPA軸的功能狀態(tài)[4]。CORT是腎上腺皮質(zhì)合成的一種糖皮質(zhì)激素，是HPA軸的終末產(chǎn)物，體液中的CORT是反映腎上腺皮質(zhì)功能的重要指標(biāo)，其分泌依賴于HPA軸的完整性[5]。應(yīng)激激活HPA軸后，腦垂體前葉分泌ACTH并使腎上腺皮質(zhì)在幾分鐘內(nèi)分泌出皮質(zhì)醇[6～7]，因此ACTH、CORT常被認(rèn)為是研究應(yīng)激的最經(jīng)典、最重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)恐懼組和正常對照組ACTH、CORT水平有顯著性差異（均為P＜0.01），表明恐懼心理應(yīng)激過程中，大鼠HPA軸被激活，釋放大量ACTH、CORT參與調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)。孤獨(dú)飼養(yǎng)組與正常對照組ACTH、CORT比較，無顯著差異（均為P＞0.05），進(jìn)一步說明實(shí)驗(yàn)造模可以排除孤獨(dú)飼養(yǎng)的影響。

IL-2主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，它能維持T細(xì)胞在體外的生長，激活多種免疫細(xì)胞，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最主要的細(xì)胞因子之一，其水平反映了T細(xì)胞的功能狀態(tài)，因此IL-2分泌水平的高低可作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。另外，IL-2對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌也具有多方面作用，它可在不同水平上影響下丘腦-垂體-腎上腺軸[8]。本實(shí)驗(yàn)各組大鼠IL-2未見顯著差異（F=1.355，P=0.280），原因可能和應(yīng)激時(shí)間、方式、強(qiáng)度有關(guān)，也可能與恐懼應(yīng)激影響指標(biāo)有關(guān)，具體關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

IL-8是一種小分子量多肽，相對分子質(zhì)量為8.3×103。IL-8分子含4個(gè)Cys，耐熱、耐堿，在pH值為2.4～9時(shí)保持活性，對巰基化合物敏感，對糜蛋白酶、胰蛋白酶有一定耐受力，其活性可被抗IL-8抗體中和[9]。是一種近年發(fā)現(xiàn)的對炎性細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)及變態(tài)反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可引起多種炎性細(xì)胞的趨化和活化，其對機(jī)體的作用是雙向的，小劑量時(shí)在防御感染和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起重要作用，但過量的IL-8又能誘發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。IL-8作用于各種免疫活性細(xì)胞，主要是趨化和激活中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，釋放超氧化物和溶酶體酶、白三烯B4、組胺等多種炎性介質(zhì)，誘發(fā)炎性反應(yīng)和組織損傷[10]。有研究證實(shí)，IL-8是重要的與心理因素相關(guān)的免疫因子[11]。本實(shí)驗(yàn)中恐懼模型組與正常對照組比較IL-8有顯著差異（P=0.015），恐懼模型組血清IL-8水平顯著高于正常對照組，提示IL-8參與了恐懼心理應(yīng)激過程，恐懼應(yīng)激可提高IL-8水平，對機(jī)體免疫功能有抑制作用，恐懼應(yīng)激對免疫功能的影響還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of fear stress in rats on the contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8

DONG Qiuan1★, LIU Xiaowei2
(1.Department of Traditional Chinese Medicine, Tongji Hospital of Tongji University, Shanghai 200065, China；2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

Objective To investigate the effects of fear stress on the endocrine and immune systems of rats with fear stress. Methods The fear stress model was established according to Takashis' method. Then, the average contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8 detected by radio immunoassay method were compared in fear group, breed lonely group and normal group. Results There was signi fi cantly difference for the level of ACTH and CORT among three groups (F=10.466, 13.804; P＜0.01). Fear stress could increase the level of ACTH and CORT, compared with other two groups (P＜0.05).There was signi fi cantly difference for the level of IL-8 among three groups (F=3.489; P=0.049) Fear stress could increase the level of IL-8, compared with normal control group (P＜0.05). For the level of IL-2, there was no signi fi cantly difference among three groups (F=1.355，P=0.280). Conclusion Fear could regulate and control the stress response by activating HPA axis and increasing the level of ACTH and CORT. Fear stress could suppress the immune system by increasing the level of IL-8.

Fear stress; Psychological stress; Endocrine-immune

國家自然科學(xué)基金（30271567）；廣東省中醫(yī)藥管理局基金 （02102074）

1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200065

2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院臨床基礎(chǔ)教研室，廣東，廣州 510515

★通訊作者：董秋安，E-mail:zimodong@sina.com