劉 品 吉 紅 李 超 黃吉芹 Marijana Todor?evi?

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院, 楊凌 712100; 2.挪威水產(chǎn)養(yǎng)殖、漁業(yè)與食品綜合研究所, 卑爾根 P.O.Box 5010)

高不飽和脂肪酸脂肪酸(Highly unsaturated fatty acid, HUFA)是指具有 20個以上碳原子, 并含有兩個或兩個以上不飽和鍵的脂肪酸, 主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)。諸多學(xué)者采用離體細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), HUFA可影響哺乳動物脂肪細(xì)胞發(fā)育[1—4]。李惠俠等[3]指出 DHA可抑制大鼠前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化, 并下調(diào)脂肪特異性分化轉(zhuǎn)錄因子—過氧化物酶體增殖激活受體 γ(Peroxisome proliferator activiated receptor γ,PPARγ)mRNA的表達(dá)量。Kim,et al.[4]也發(fā)現(xiàn)DHA可抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化, 促進(jìn)脂肪細(xì)胞水解, 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

盡管HUFA并非草魚的必需脂肪酸, 但已有研究證實(shí)其對草魚的脂質(zhì)代謝有著顯著的影響, 且該方面的研究多采用在體的方式[5—9]。如吉紅等[8,9]用富含 EPA和 DHA的日糧飼喂草魚, 發(fā)現(xiàn)其可抑制草魚脂質(zhì)合成并減少脂質(zhì)向肝臟組織的轉(zhuǎn)運(yùn), 最終降低肝胰臟脂肪及腹腔脂肪的沉積。近年來, 隨著魚類脂肪細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立[10—13], 采用離體模型進(jìn)行脂質(zhì)代謝的研究也逐漸增多[14—17]。Todor?evi?,et al.[14]用不同脂肪酸處理大西洋鮭前體脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn), EPA可顯著降低脂肪細(xì)胞蓄積甘油三酯的能力。而EPA對草魚脂肪細(xì)胞影響的研究尚未見報道。

為了深入探究HUFA對草魚脂質(zhì)代謝的影響及其機(jī)理, 在本實(shí)驗(yàn)室已建立的草魚脂肪細(xì)胞培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上, 研究了EPA對體外培養(yǎng)的草魚脂肪細(xì)胞增殖分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響, 以期為草魚HUFA營養(yǎng)機(jī)理研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動物 體重1 kg左右健康草魚, 購于楊凌康樂市場。

主要試劑 DMEM/F12固體培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(四季青)、Ι型膠原酶(Gibco) 、牛血清白蛋白(Gibco)、無脂肪酸牛血清白蛋白(北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)、牛胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、氫化可的松、油紅O、MTT、EPA均購自Sigma公司, 碳酸氫鈉、無水乙醇等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

草魚前體脂肪細(xì)胞獲得及培養(yǎng) 試驗(yàn)魚在水族箱中停食暫養(yǎng)1d左右。試驗(yàn)前將魚敲暈后剪斷鰓弓放血, 清洗干凈并用75%酒精擦拭魚體進(jìn)行消毒,無菌環(huán)境中解剖取出腹腔腸系膜脂肪組織, 將其放入含 5%牛血清白蛋白的 PBS緩沖液中, 并稱量記錄分離的脂肪組織總重量。

將取出的脂肪組織用PBS沖洗3次后放入燒杯,加入等體積的0.1% Ι型膠原酶消化液, 剪碎組織的同時對組織進(jìn)行消化, 15min后用含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)。隨后將混合液放于50 mL離心管, 800 g離心10min, 棄上層液體, 用不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基將沉淀的細(xì)胞重懸, 吹打均勻, 將細(xì)胞懸浮液通過 200目的尼龍網(wǎng)過濾, 收集濾液, 800 g離心10min, 棄上層液體, 加入20 mL紅細(xì)胞裂解液, 靜置5min, 800 g離心5min, 棄去上清。將獲得的草魚前體脂肪細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液重懸清洗, 800 g離心5min, 重復(fù)兩次后用含20%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸, 以10 g/25 cm2密度接種于預(yù)先用 1%明膠涂布板底的培養(yǎng)板內(nèi),于28℃, 5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng), 隔天換液并觀察細(xì)胞增殖發(fā)育情況。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合階段(接種6d), 給細(xì)胞換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng), 具體流程(圖1)。

MTT法檢測草魚前體脂肪細(xì)胞增殖 按照前述方法獲得草魚前體脂肪細(xì)胞并培養(yǎng), 待細(xì)胞貼壁后, 分別用加有0、50、100 μmol/L EPA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行處理, 處理1、2、3和4后通過MTT比色測定草魚前體脂肪細(xì)胞增殖活性。每孔加入 20 μL新鮮配制的MTT溶液, 28℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液, 每孔加 150 μL DMSO, 震蕩10min。波長490 nm處, 以經(jīng)過相同處理的無細(xì)胞孔作為空白進(jìn)行調(diào)零, 在全波長酶標(biāo)儀(Gene, USA)上測定各孔OD值。

油紅O染色提取法檢測草魚前體脂肪細(xì)胞分化按照前述方法培養(yǎng)細(xì)胞, 待細(xì)胞增殖達(dá)到80%以上匯合后, 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別加入0、50、100 μmol/L EPA, 分別取誘導(dǎo)分化1、3和5d的細(xì)胞, 各孔細(xì)胞用PBS洗3次, 10%甲醛溶液固定30min后, 用PBS洗2次, 紅油O染色液浸染10min, PBS洗2次, 異丙醇分色20s,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色情況并拍照。隨后每孔加入1 mL異丙醇, 恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩10min以萃取被染細(xì)胞中的油紅 O, 以相同處理的無細(xì)胞孔作為空白調(diào)零, 紫外分光光度計(島津UVmini 1240,Japan)500 nm波長處比色, 記錄OD值。

Real-time qPCR檢測基因表達(dá)情況 當(dāng)細(xì)胞增殖到80%匯合時(接種6d)分別用0、100 μmol/L EPA處理。2d后吸棄培養(yǎng)液, 室溫下PBS洗滌2—3次, 提取RNA, 取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 方法參照 TakaRa公司的 PrimeScript?RT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書。實(shí)時定量檢測采用CFX-96實(shí)時定量 PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)進(jìn)行, 反應(yīng)體系為 20 μL, 包括： 10 mmol/μL 的上下游引物各 0.6 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR?Premix ExTaq? II S、7.8 μL 滅菌水。反應(yīng)條件為： 95℃, 10s; 95℃, 15s; 57℃,15s; 40個循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值(熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)), 計算出目標(biāo)基因與內(nèi)參基因β-actinCt值的差異ΔCt, 計算出不同樣品相對于內(nèi)參基因表達(dá)倍數(shù) 2?ΔCt, 從而制作相對定量的圖表?；驒z測實(shí)時定量引物(表1)。

圖1 草魚前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)模式圖Fig.1 Summary of grass carp preadipocytes development

表1 實(shí)時定量檢測引物列表Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用 SPSS13.0軟件中單因素方差分析(One-way ANOVA)和t檢驗(yàn)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析,當(dāng)P<0.05時, 認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 草魚前體脂肪細(xì)胞發(fā)育過程

草魚前體脂肪細(xì)胞接種第1天(圖2A), 隔天換液, 培養(yǎng)第 4天可見貼壁細(xì)胞伸展呈梭形, 并開始形成草魚前體脂肪細(xì)胞增殖群落(圖2B), 接種6d后,前體脂肪細(xì)胞大量增殖, 可覆蓋培養(yǎng)皿底面積 80%(圖 2C), 此時換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。接種 14d(誘導(dǎo)培養(yǎng) 8d)部分細(xì)胞分化完全, 胞內(nèi)形成若干大脂滴(圖 2D)。

2.2 EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞增殖的影響

從表2中可以看出, 50 μmol/L EPA處理脂肪細(xì)胞2d內(nèi)可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P<0.05), 但是從3d起其促進(jìn)作用消失(P>0.05), 到第4天轉(zhuǎn)為抑制作用(P<0.05); 100 μmol/L EPA組在前3天始終對草魚前體脂肪細(xì)胞的增殖起到顯著的促進(jìn)作用(P<0.05),到第4天促進(jìn)作用消失(P>0.05)。

2.3 EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞分化的影響

EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞脂質(zhì)蓄積能力的影響在草魚前體脂肪細(xì)胞分化第 1天, 分別用含 50 μmol/L和100 μmol/L EPA的培養(yǎng)液孵育處理細(xì)胞1d后, 通過油紅O脂滴特異染色后發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞內(nèi)被油紅O染成亮紅色的脂滴數(shù)與充脂細(xì)胞數(shù)減小較對照組減少(圖 3)。油紅 O染色提取法比色法(以 OD值表示)定量分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的生成量, 結(jié)果表明,EPA處理 1d可顯著降低細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)生成量(P<0.05, 圖 4)。但是隨著處理時間的延長, EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞分化的抑制效果逐漸減弱, 處理組脂滴數(shù)量與大小逐漸趕上對照組。并且, 處理組脂質(zhì)含量測定結(jié)果也與對照組相近(P>0.05)(圖4)。

EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞分化初期脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖5所示, 100 μmol/L EPA處理脂肪細(xì)胞2d后, 顯著促進(jìn)了細(xì)胞LPL和PGC-1α基因的表達(dá)(P<0.05), 而對PPARs家族基因的表達(dá)無顯著性影響(P>0.05, 圖5)。

3 討論

脂肪組織發(fā)育的實(shí)質(zhì)是脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加和體積的增大, 而脂肪細(xì)胞由不含大脂滴的前體脂肪細(xì)胞發(fā)育為儲存脂質(zhì)的成熟脂肪細(xì)胞受到許多因子調(diào)控。EPA和 DHA是魚油中最主要的多不飽和脂肪酸, 它們均具有抑制動物體甘油三酯合成的作用。研究表明, EPA可改善肥胖及肥胖相關(guān)的疾病如胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病, 提高脂肪組織、肝臟和肌肉組織的胰島素敏感性, 并促進(jìn)葡萄糖利用[18,19]; DHA可劑量和時間依賴性地降低3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和原代培養(yǎng)的大鼠前體脂肪細(xì)胞的增殖活力[1,2]。本研究則首次探討了 EPA在離體條件下對草魚脂肪細(xì)胞發(fā)育的影響, 發(fā)現(xiàn) EPA處理前2d可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖, 但是到增殖的第4天 50 μmol/L處理組呈現(xiàn)出顯著抑制作用, 這一現(xiàn)象與DHA在3T3-L1及大鼠上的作用存在差異, 表明不同種類脂肪酸對于脂肪細(xì)胞增殖的影響可能存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。相關(guān)研究尚需進(jìn)一步進(jìn)行。

表2 MTT檢測EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effects of EPA on preadipocytes proliferation of grass carp by MTT assay

前體脂肪細(xì)胞分化是甘油三酯沉積的過程, 涉及一系列的轉(zhuǎn)錄事件。PPARs家族的三個成員(PPARα、PPARβ、PPARγ)在脂肪細(xì)胞脂肪酸代謝中發(fā)揮著重要的作用。PPARα主要在脂肪酸的氧化代謝中發(fā)揮重要作用, 但是它在白色脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量較低; PPARγ則在細(xì)胞的脂質(zhì)生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用, 在白色脂肪細(xì)胞中得表達(dá)量較高; PPARβ在脂肪組織代謝和能量的動態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用[20]。Chambrier,et al.[21]在人的脂肪細(xì)胞上研究發(fā)現(xiàn)EPA可顯著促進(jìn)PPARγ表達(dá), 但Yoshiyuki,et al.[22]對 3T3-L1的研究發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果,且沒有對分化造成影響。Manickam,et al.[23]則指出EPA可顯著降低脂肪細(xì)胞脂滴的大小以及脂質(zhì)含量。在本研究中, EPA沒有影響PPARs家族3個成員的表達(dá), 但卻在分化初期顯著抑制了草魚脂肪細(xì)胞蓄積甘油三酯的能力(圖 4), 與 Manickam,et al.[23]在 3T3-L1上的研究結(jié)果一致。

另一方面, 本研究發(fā)現(xiàn) EPA顯著促進(jìn)了脂質(zhì)分解基因LPL和線粒體生成相關(guān)基因PGC-1α的表達(dá)(圖5)。LPL是脂肪細(xì)胞平衡脂質(zhì)生成與分解的限制酶[24]。Todor?evi?,et al.[25]研究發(fā)現(xiàn)LPL在大西洋鮭前體脂肪細(xì)胞發(fā)育過程中相對于接種第 1天呈現(xiàn)先升高后降低最后又升高的波動趨勢, 在細(xì)胞增殖過程中LPL表達(dá)升高, 細(xì)胞匯合后至細(xì)胞分化中期LPL表達(dá)降低, 細(xì)胞分化后期LPL表達(dá)升高。在本試驗(yàn)中,在草魚前體脂肪細(xì)胞分化初期, EPA促進(jìn)了LPL的表達(dá), 表明EPA可能通過LPL促進(jìn)了細(xì)胞的脂質(zhì)分解從而降低了細(xì)胞脂質(zhì)的蓄積能力。Manickam,et al.[23]的研究表明EPA可上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞LPL和HSL等基因的表達(dá), 并抑制脂肪細(xì)胞的分化。Mak-Soon,et al.[26]則發(fā)現(xiàn)EPA可通過上調(diào)脂質(zhì)分解基因和下調(diào)脂質(zhì)合成基因促進(jìn) 3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解。另一方面, 也有研究表明攝入魚油可促進(jìn)人和小鼠脂肪組織LPL基因的表達(dá)[27,28], 本研究結(jié)果與之一致。以上結(jié)果表明, EPA有可能通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積。

PGC-1α參與調(diào)控線粒體的生成[29]、適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、肝臟脂肪酸β氧化、脂肪細(xì)胞分化等多種代謝過程[30], 在調(diào)節(jié)能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。PGC-1α在有高能量需求及線粒體豐富的組織中表達(dá)水平相對較高, 而在白色脂肪細(xì)胞表達(dá)極少[31]。Lu,et al.[32]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α在豬的前體氧化代謝基因核呼吸因子(Nuclear respiratory factor-1,Nrf-1)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室曾報道飼喂HUFA可顯著促進(jìn)草魚肝臟PGC-1α基因的表達(dá)[34], 且肝臟脂質(zhì)含量也顯著下降。有學(xué)者在人的脂肪細(xì)胞中超表達(dá)PGC-1α, 結(jié)果致使脂肪細(xì)胞儲能作用變成能量耗散作用[35]。在本實(shí)驗(yàn)中 EPA促進(jìn)了脂肪細(xì)胞PGC-1α基因的表達(dá), 同時發(fā)現(xiàn) EPA處理組細(xì)胞的脂質(zhì)含量顯著低于對照組, 推測PGC-1α的表達(dá)升高促進(jìn)了細(xì)胞線粒體的增殖發(fā)育, 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對脂肪酸的氧化分解, 最終通過抑制脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成降低脂質(zhì)蓄積。

圖2 草魚前體脂肪細(xì)胞發(fā)育過程圖Fig.2 Morphology of grass carp preadipocytes development

圖3 EPA對草魚脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)的影響Fig.3 Morphological changes of grass carp adipocytes treated with EPA

圖4 EPA對草魚前體脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.4 Effects of EPA on differentiation of grass carp preadipocytes by Oil Red O extraction

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