馮興軍，李 靜，宋雪瑩，許文杉，邢麗維，柳 迪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是生物體在病原體刺激下，免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類具有生物學(xué)活性小分子多肽，是動(dòng)植物非特異免疫系統(tǒng)重要成分[1]，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、高等植物、昆蟲、兩棲類、哺乳動(dòng)物以及人類體內(nèi)[2]?？咕木哂锌咕?、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。和抗生素相比，抗菌肽具有分子質(zhì)量小、抗菌譜廣、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無(wú)免疫原性和作用機(jī)制獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，不易引起微生物耐藥性，被認(rèn)為是替代抗生素有效藥物之一[5]。

雞源抗菌肽Fowlicidins-2能夠快速殺菌，受鹽離子濃度影響小，對(duì)抗性菌株有很強(qiáng)抑制作用[6]。天蠶素B（Cecropin B）具有抑制腫瘤細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)損傷，對(duì)DNA、RNA病毒有很強(qiáng)抑制作用[7]。Merrifield等對(duì)天蠶素A（Cecropin A）和蜂毒素（Melittin）進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造后得到Cecropin A（1-8）-Melittin（1-18），不但沒(méi)有蜂毒素溶血作用，其抗菌活性也有明顯提高，且該雜合肽還具有較天蠶素A和蜂毒素更廣抗菌譜[8]。死亡素（Thanatin）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)G+菌、G-菌和某些真菌都有抑制作用，但是對(duì)金黃色葡萄球菌活性較低，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不表現(xiàn)出溶血性。本研究根據(jù)這四種抗菌肽氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成四種抗菌肽融合基因，并利用基因工程方法在畢赤酵母中成功表達(dá)，為基因工程方法制備抗菌肽尋求技術(shù)路線，為進(jìn)一步研究其功能和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株

質(zhì)粒pPICZαC、畢赤酵母SMD1168購(gòu)自Invit?rogen公司；E.coliDH 5α、E.coliATCC25922、S.aureusATCC25923、S.syphimuriumC77-31和P.ae?ruginosaATCC27853為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶XholⅠ、XbalⅠ、SacⅠ、T4連接酶（購(gòu)自Takara（大連）有限公司）；DNA分子質(zhì)量Marker、小分子質(zhì)量蛋白Maker、Zeocin、Tri?cine（購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（購(gòu)自北京康為生物公司）；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；多核苷酸及DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽FAPs基因設(shè)計(jì)與合成

將4種抗菌肽Fowlicidin-2、Cecropin B、Ce?cropin A(1-8)-Melittin(1-18)、Thnantin 串聯(lián)，并在每種抗菌肽N端加入Kex2裂解位點(diǎn)（-Glu-Lys-Arg-），形成四種抗菌肽串聯(lián)體FAPs，根據(jù)FAPs氨基酸序列，化學(xué)合成具有酵母密碼子偏愛(ài)性編碼基因，并在編碼基因5'和3'端分別引入XholⅠ、XbalⅠ酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)好的基因核苷酸序列送由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并連入載體pUC57。

1.2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

XholⅠ、XbalⅠ雙酶切含有目基因克隆載體，獲得目的基因，與表達(dá)載體pPICZαC連接，轉(zhuǎn)化E.coli的DH 5α[9]。PCR篩選陽(yáng)性克隆，所用引物為載體上的通用引物，上游引物：5'GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC 3'；下游引物：5'GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC 3'，反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。提取質(zhì)粒通過(guò)XholⅠ、XbaⅠ雙酶切、DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-FAPs。

1.2.3 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

SacⅠ線性化pPICZαC-FAPs（5～10 μg），電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，轉(zhuǎn)化條件：3 000 V、25 μF、200 Ω電擊5 ms，30 ℃溫育復(fù)性1～1.5 h后涂MD（含100 μg·mL-1Zeocin）平板，30℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子，用凍-煮-凍法[10]制備PCR模板，所用引物及PCR反應(yīng)條件同1.2.2。

1.2.4 抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選得到的酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、280 r·min-1培養(yǎng)16～17 h，取50 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到25 mL BMGY中，30℃、300 r·min-1培養(yǎng)到OD值為2～6，收集菌體轉(zhuǎn)接于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，30℃、300 r·min-1、1%甲醇誘導(dǎo)72 h，其間每隔24 h補(bǔ)加甲醇使其終濃度為0.5%～1%。誘導(dǎo)后離心收集上清，冷凍干燥，取樣15%Tricine-SDS-PAGE分析[11]，Bradford法測(cè)定上清中蛋白含量。

1.2.5 重組FAPs抗菌活性初步測(cè)定

直徑為5 mm圓形濾紙片高壓蒸汽滅菌，放入pPICZαC-FAPs轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清中，浸泡2 h，取出風(fēng)干備用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期E.coliATCC25922用PBS制成懸液，調(diào)整OD600至0.2左右，此時(shí)細(xì)菌濃度約為5×107cfu·mL-1，取0.2 mL菌懸液加在LB瓊脂平板上，均勻涂開(kāi)。將濾紙片放在平板上，以pPICZα-C空載轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)上清浸泡濾紙片為陰性對(duì)照，37℃倒置培養(yǎng)18 h。

1.2.6 重組FAPs最小抑菌濃度測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定重組FAPs抑菌活性。0.02%乙酸溶液（含0.4%牛血清白蛋白）稀釋FAPs，得到2倍梯度度稀釋抗菌肽貯存液（2 560，1 280，…，10和5 μg·mL-1），存放于聚丙烯離心管中。測(cè)試菌接種于MHA培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，將測(cè)試菌過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋至 2×105～7×105cfu·mL-1，分別取100 μL加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每行1～11號(hào)孔，將按梯度稀釋抗菌肽11 μL對(duì)應(yīng)加到1～10號(hào)孔，11號(hào)孔不加抗菌肽，作為陽(yáng)性對(duì)照，12號(hào)孔加入100 μL新鮮MHB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)18至24 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm吸光值。吸光度比11號(hào)孔低50%以上孔內(nèi)濃度即定義為對(duì)該測(cè)試菌最小抑菌濃度MIC。試驗(yàn)在無(wú)菌條件下操作，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAPs編碼基因合成及重組表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1 FAPs編碼基因合成

根據(jù)四種抗菌肽氨基酸序列，設(shè)計(jì)具有酵母密碼子偏愛(ài)性編碼基因，在每種抗菌肽N-端加入編碼Kex2裂解位點(diǎn)（-Glu-Lys-Arg-）3個(gè)密碼子，在編碼基因5'和3'端分別引入XholⅠ、XbalⅠ酶切位點(diǎn)，編碼序列大小381 bp，化學(xué)方法合成并克隆到pUC57。

2.1.2 重組表達(dá)載體pPICZαC-FAPs的構(gòu)建

PCR所用上下游引物分別與pPICZαC855-875、1 423～1 443間堿基互補(bǔ)，以該對(duì)引物篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，含有質(zhì)粒pPICZαC菌落為模板PCR產(chǎn)物DNA條帶為588 bp，而陽(yáng)性重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶為882 bp。測(cè)序結(jié)果表明，堿基序列與設(shè)計(jì)完全一致，說(shuō)明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.2 FAPs在畢赤酵母SMD1168中表達(dá)

2.2.1 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化

重組表達(dá)載體經(jīng)SacⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，利用PCR方法進(jìn)一步篩選陽(yáng)性菌落，如圖2所示，陽(yáng)性對(duì)照，即以含有質(zhì)粒pPICZαC酵母菌落為模板的PCR產(chǎn)物為588 bpDNA條帶，而陽(yáng)性重組質(zhì)粒，即以含有重組質(zhì)粒pPICZαC-FAPs酵母菌落為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物為882 bp DNA條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒pPICZαC-FAPs和質(zhì)粒pPICZαC已成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母SMD1168中。

圖1 PCR方法篩選重組質(zhì)粒pPICZαC-FAPsFig.1 PCR screening of the recombinant plasmid pPICZαC-FAPs

圖2 PCR方法篩選pPICZαC-FAPs酵母轉(zhuǎn)化子Fig.2 PCR screening of the yeast transformant of pPICZαC-FAPs

2.2.2 FAPs誘導(dǎo)表達(dá)

按照優(yōu)化誘導(dǎo)條件，30℃、pH 6.0、甲醇終濃度為1%，誘導(dǎo)72 h，取上清冷凍干燥后，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，如圖3所示，重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-FAPs轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生一條約為14 ku特異蛋白帶，與預(yù)期FAPs蛋白大小大小一致，上清中蛋白濃度為32 mg·L-1。

圖3 pPICZαC-FAPs轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis of the expression of P.pastoris transformed with the recombinant plasmid pPICZαC-FAPs

2.3 FAPs抑菌活性初步檢測(cè)

為初步檢測(cè)所表達(dá)FAPs是否具有抗菌活性，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期E.coliATCC25922為指示菌，利用紙片法檢測(cè)FAPs抗菌活性，結(jié)果如圖4所示，含有FAPs上清處理紙片周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈，而對(duì)照紙片周圍沒(méi)有出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，表明抗菌肽FAPs具有一定抑菌活性。

圖4 FAPs對(duì)E.coli ATCC25922抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of FAPs against E.coli

2.4 FAPs抑菌活性測(cè)定

利用微量肉湯稀釋法測(cè)定抗菌肽FAPs對(duì)E.coliATCC25922、S.aureusATCC25923、S.typhimuriumC77-31和P.aeruginosaATCC27853最小抑菌濃度MIC，隨著抗菌肽濃度提高，四種菌生長(zhǎng)均受到不同程度抑制，如表1所示，測(cè)得FAPs對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)，其MIC值為8.0 μg·mL-1。

3 討論與結(jié)論

抗菌肽無(wú)殘留、無(wú)毒害、具有廣譜抗菌能力，受到越來(lái)越多關(guān)注。自然界中存在豐富抗菌肽資源，可利用這些抗菌肽作模版，人工設(shè)計(jì)并合成功能型小肽。由于天然存在抗菌活性偏低、甚至對(duì)真核生物細(xì)胞具有毒性、引起紅細(xì)胞溶血缺點(diǎn)，因此抗菌肽存在很大改造空間[12]。目前改造抗菌肽主要方法包括：①氨基酸殘基替換[13]；②截取天然抗菌肽部分氨基酸序列[14]；③雜合肽，即將兩種或兩種以上抗菌肽經(jīng)改造后連接在一起[15]，雜合抗菌肽表現(xiàn)出較天然抗菌肽更高抗菌活性[16]。

近年來(lái)利用基因工程方法已經(jīng)成功表達(dá)多種抗菌肽，對(duì)建立肽基因工程菌和抗菌肽研究具有重要意義。畢赤酵母作為表達(dá)外源蛋白宿主菌，營(yíng)養(yǎng)要求低，易于培養(yǎng)。存在酵母氧化酶AOX1基因，將其作為外源基因啟動(dòng)子，受甲醇誘導(dǎo)，能夠嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白表達(dá)。在表達(dá)過(guò)程中酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白較少，簡(jiǎn)化后期蛋白分離與純化過(guò)程，具有遺傳高穩(wěn)定性。畢赤酵母還可以對(duì)表達(dá)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾，使表達(dá)蛋白質(zhì)獲得正確折疊、糖基化和N-末端加工，從而使表達(dá)蛋白具有生物活性。畢赤酵母SMD 1168，是一類蛋白酶缺失宿主菌[17]，表達(dá)過(guò)程中能保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量提高。

為提高抗菌肽抗菌活性，消除抗菌肽溶血性及細(xì)胞毒性，本研究根據(jù)四種抗菌肽結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)合成抗菌肽FAPs，并選擇畢赤酵母SMD1168為表達(dá)宿主菌進(jìn)行表達(dá)，成功獲得大小為14 ku抗菌肽FAPs，產(chǎn)量為32 mg·L-1。經(jīng)抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明FAPs對(duì)G+及G-菌均有不同程度抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng)，其MIC為8.0 μg·mL-1。雖然得到具有抑菌活性重組抗菌肽FAPs，但還需對(duì)其他生物活性，如抗菌譜、免疫原性、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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