彭李博 綜述，王建東 審校

(本文編輯:張仲書)

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞激酶(erythropoietin producing hepatocyte kinase，Eph)受體是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族最大的亞族，分為Eph A和Eph B受體。Eph受體及其配體Ephrin之間的信號(hào)傳遞在生物體的胚胎發(fā)育、神經(jīng)軸突導(dǎo)向和血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)Eph受體及其配體在大腸癌組織中的異常表達(dá)，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)。Eph及其配體Ephrin有可能成為預(yù)防和治療大腸癌的一個(gè)新靶標(biāo)，本文就近年來(lái)Eph基因與結(jié)直腸癌的相關(guān)研究綜述如下。

1 Eph基因家族組成

1.1 Eph的發(fā)現(xiàn)與命名 1987年 Hirai等［1］發(fā)現(xiàn)Eph基因，在克隆出該基因全部cDNA序列后，發(fā)現(xiàn)該基因在一株產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的人肝癌細(xì)胞系ETL-1中呈現(xiàn)高表達(dá)，故命名該新基因?yàn)镋ph基因。根據(jù)序列同源性、結(jié)構(gòu)與配體結(jié)合特性的不同，Eph受體被分為Eph A和Eph B兩個(gè)亞族，配體分Ephrin A和Ephrin B兩個(gè)亞型。其中Eph A受體包括Eph A1～10，其配體為Ephrin A1～6；Eph B受體包括Eph B1～6，其配體為Ephrin B1～3。

1.2 Eph的結(jié)構(gòu) Eph為跨膜I型糖蛋白，分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域：糖基化的胞外區(qū)、細(xì)胞內(nèi)具有酪氨酸激酶活性的功能區(qū)(胞內(nèi)區(qū))和連接二者的由疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)。胞外區(qū)由免疫球蛋白樣元件的配體結(jié)合域、1個(gè)半胱氨酸富含區(qū)(有20個(gè)半胱氨酸殘基)、1個(gè)N端球狀結(jié)構(gòu)域和2個(gè)纖維結(jié)合蛋白Ⅲ型同源區(qū)組成，其N端球狀結(jié)構(gòu)域決定了受體與配體結(jié)合的特性和亞族特異性；胞內(nèi)區(qū)包含近膜區(qū)、保守的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域(sterile α motif，SAM)和 C端的突出后密度蛋白-大盤-密閉小帶(Post-synaptic density protein，Discs large，Zonula occludens，PDZ)結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。近膜區(qū)、激酶結(jié)構(gòu)域、SAM結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)酪氨酸殘基，它們的磷酸化可為包含SH2/SH3結(jié)構(gòu)域(Src-Homology-2/3)或磷酸化酪氨酸結(jié)合(phospho-tyrosine binding，PTB)結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)。高度保守的SAM結(jié)構(gòu)域可通過(guò)同源或異型聚物的形成來(lái)介導(dǎo)蛋白間相互作用，為啟動(dòng)下游反應(yīng)及為結(jié)合小分子量磷酸酶提供適宜的接觸部位。PDZ結(jié)合基序與包含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合后可為膜上蛋白復(fù)合物的組裝提供平臺(tái)。

1.3 Ephrin的結(jié)構(gòu) Ephrin A通過(guò)糖基磷脂酰肌醇鏈錨定在細(xì)胞膜上，Ephrin B為單次跨膜蛋白，包括信號(hào)區(qū)、結(jié)合區(qū)、間隔區(qū)和疏水區(qū)。Ephrin B的羧基末端由保守的酪氨酸殘基和 PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序組成，可為包含 SH2/SH3或 PTB結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白提供停泊位點(diǎn)(圖1)。

圖1 Eph和Ephrin結(jié)構(gòu)模式圖

2 Eph基因的生理功能

Eph受體與其配體Ephrin之間相互作用，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)胚胎發(fā)育、神經(jīng)軸突導(dǎo)向、血管生成等方面起到了重要的作用［2］。

在維持生物體胚胎發(fā)育方面，在胚胎發(fā)育過(guò)程中Eph B2受體和Ephrin B配體系統(tǒng)對(duì)后腦的形成發(fā)揮了重要作用，Eph B2受體與鄰近細(xì)胞表面的Ephrin B配體的結(jié)合啟動(dòng)雙向細(xì)胞信號(hào)通道傳遞，導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞之間的排斥，限制了鄰近細(xì)胞群的混雜，從而調(diào)控細(xì)胞的遷徙和黏附，以維持組織和細(xì)胞正常的空間排列和形態(tài)。Batlle［3］的研究進(jìn)一步肯定了這種作用，在Eph B2受體表達(dá)缺陷的小鼠腸道黏膜中，觀察到具有增殖和分化能力的各種前體細(xì)胞遷移定位導(dǎo)向錯(cuò)亂，不能到達(dá)正確的位置，吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及潘式細(xì)胞的前體細(xì)胞沿著隱窩―鞭毛軸混亂排列，同種細(xì)胞相互聚集。Eph B2表達(dá)缺失導(dǎo)致腸道黏膜細(xì)胞排列紊亂，改變了各種細(xì)胞的生存內(nèi)環(huán)境，對(duì)細(xì)胞代謝亦產(chǎn)生一定的影響。

在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)軸突導(dǎo)向方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線結(jié)構(gòu)表達(dá)Ephrin的細(xì)胞，與其他軸突競(jìng)爭(zhēng)投射部位，并在已穿過(guò)中線結(jié)構(gòu)的周圍有Eph的代償性表達(dá)，以避免軸突再次穿過(guò)中線。由此，軸突可以發(fā)現(xiàn)正確投射路徑，形成完整的神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)［4］。利用基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ephrin B配體在表達(dá)軸突中傳導(dǎo)信號(hào)，通過(guò)Ephrin B配體與Eph B受體胞外結(jié)合域的相互作用，顯示出介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)形成大腦前連合，或者形成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突。事實(shí)上，當(dāng)小鼠缺乏某一特定的Eph B基因，就出現(xiàn)軸突投射異常，但這種介導(dǎo)錯(cuò)誤會(huì)被以表達(dá)缺乏激酶結(jié)合域但含有胞外結(jié)合域的Eph B2的修整形式所糾正。Eph B2的內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)功能作為介導(dǎo)軸突并非必須，而其胞外結(jié)合域卻扮演著重要角色，推測(cè)是通過(guò)激活Ephrin B配體的信號(hào)傳導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。

在控制血管生成方面，Eph受體作為受體酪氨酸激酶家族之一，與其配體結(jié)合能控制血管生成。Ephrin A1是Eph受體第一個(gè)被明確的配體，為一種被腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的基因，已從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞克隆出。在非成人組織早期器官形成的胚胎內(nèi)皮細(xì)胞中已可檢測(cè)Ephrin A1轉(zhuǎn)錄，這預(yù)示著Ephrin A1配體在血管形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮生理功能。Eph B2受體與配體Ephrin B2結(jié)合活化，在動(dòng)脈形成中調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞相互間的聯(lián)系，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。Ephrin B2羧基端缺乏PDZ模序可擾亂淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻止末梢毛細(xì)淋巴管床的形成，而Ephrin B2中的PDZ模序?qū)τ谘艿陌l(fā)育并不是必須的。據(jù)此推測(cè)，Ephrin B2可能是通過(guò)不同的信號(hào)機(jī)制來(lái)控制血管和淋巴管生長(zhǎng)。

3 Eph A亞群在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

Saito等［5］運(yùn)用免疫組化方法對(duì)194例原發(fā)性結(jié)直腸癌進(jìn)行Eph A2的表達(dá)研究，他們發(fā)現(xiàn)Eph A2的高表達(dá)與腫瘤肝轉(zhuǎn)移、淋巴管侵襲以及臨床分期有關(guān)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系也非常明顯。Eph A2和Ephrin A1有助于誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成，Eph A2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)高于正常黏膜，在Ⅰ、Ⅱ期腫瘤中的表達(dá)高于Ⅲ、Ⅳ期；在直徑≤5 cm腫瘤中的表達(dá)高于直徑＞5 cm者，由此推斷Eph A主要在結(jié)直腸癌早期階段發(fā)揮重要作用。Dong等［6］研究發(fā)現(xiàn)Eph A1在腸癌細(xì)胞中表達(dá)程度不同，并存在甲基化傾向。Eph A1蛋白在腸腺瘤中呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性，在癌組織中不表達(dá)或低表達(dá)；低表達(dá)多見(jiàn)于低分化腺癌、腸壁浸潤(rùn)程度更深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Eph A1下調(diào)多見(jiàn)于中晚期病例，下調(diào)較上調(diào)患者預(yù)后不良，表達(dá)越低，生存率越低，研究［7］證實(shí)，去甲基化處理可以使Eph A1重新表達(dá)。Wang等［8］檢測(cè)大腸癌細(xì)胞系中Eph A7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞系DLD1、HT29、HCT116、SW480和 SW620中 Eph A7基因低表達(dá)。經(jīng)甲基化特異性引物基因擴(kuò)增、亞硫酸氫鈉處理后DNA測(cè)序等，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化。進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR技術(shù)［9］，檢測(cè)出結(jié)直腸癌患者血漿中微量游離DNA中甲基化的Eph A7基因，提示啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是Eph A7在大腸癌中低表達(dá)的機(jī)制，血漿甲基化Eph A7可能作為一種新的腫瘤標(biāo)志物。Xi等［10］研究發(fā)現(xiàn)Eph A3在大腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常黏膜，Eph A3的表達(dá)與腫瘤的大小、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，Eph A3的高表達(dá)與低生存率相關(guān)。Eph A3可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，可作為腫瘤治療臨床評(píng)估和評(píng)價(jià)大腸癌預(yù)后的一個(gè)有利指標(biāo)。Oshima等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Eph A2的過(guò)表達(dá)與Eph B1的低表達(dá)可能促進(jìn)大腸癌的肝轉(zhuǎn)移，提示有可能成為預(yù)測(cè)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的一個(gè)有效指標(biāo)。Eph A在大腸癌發(fā)生的不同階段其表達(dá)情況不一致，Eph A的表達(dá)與大腸癌的分級(jí)與分期存在一定的相關(guān)性，但目前關(guān)于Ephrin A在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道較少，還有待進(jìn)一步的研究［12］。

4 Eph B亞群在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

4.1 Eph B受體的高表達(dá) 早期的研究提示多種Eph B家族的成員在人結(jié)直腸癌高表達(dá)，在癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用。Martiny-Baron等［13］研究發(fā)現(xiàn)Eph B4的表達(dá)在結(jié)直腸癌中明顯上調(diào)，但因研究樣本數(shù)較少(n=15)，在對(duì)比Eph B4在正常和癌組織中的表達(dá)差異時(shí)，未就Eph B4在不同腫瘤分期中的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比。

4.2 Eph B受體的低表達(dá) 新近發(fā)現(xiàn)Eph B的表達(dá)在結(jié)直腸癌中存在不同程度的下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和患者的生存期相關(guān)，Eph B的表達(dá)越少，腫瘤的惡性程度就越高，患者的生存期就越短。Batlle 等［14］和 Clevers等［15］檢測(cè)了 Eph B2受體在正常腸隱窩干細(xì)胞、腸腺瘤細(xì)胞、腸原位癌細(xì)胞、腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞和肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Eph B2受體在他們中的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)在小鼠結(jié)直腸癌模型中，使用基因工程技術(shù)干擾癌細(xì)胞Eph B2受體的表達(dá)，Eph B2受體的缺失加快了結(jié)直腸腫瘤的形成。這項(xiàng)研究提示，大多數(shù)大腸癌細(xì)胞在腺瘤和癌之間的過(guò)渡階段失去了Eph B2受體的表達(dá)，并且Eph B2表達(dá)的多少與腸癌的浸潤(rùn)深度和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Eph B2的表達(dá)越低，腫瘤分化越差，浸潤(rùn)程度越深，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移越多。這些結(jié)果在其他一些獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中也得到了進(jìn)一步的支持，Guo等［16］研究認(rèn)為，Eph B2在正常結(jié)腸黏膜底部腺管的上皮細(xì)胞表面、在78.0%的腺瘤、55.4%的原發(fā)性結(jié)腸癌、37.8%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和39.2%的肝轉(zhuǎn)移組織中存在表達(dá)；結(jié)腸癌Dukes C期和D期表達(dá)低于A期和B期，中晚期結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)低于原發(fā)癌，肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)低于原發(fā)灶，在結(jié)腸癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)中亦證明了過(guò)度表達(dá)的Eph B2受體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附和轉(zhuǎn)移，推測(cè)Eph B2在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的每一個(gè)關(guān)鍵步驟中持續(xù)減少、表達(dá)缺失是預(yù)后不良的強(qiáng)烈指標(biāo)。Merlos-Suarez等［17］發(fā)現(xiàn)成人腸道干細(xì)胞被高表達(dá)的Eph B2受體標(biāo)記，被標(biāo)記的干細(xì)胞在大腸癌的復(fù)發(fā)中起到了核心作用。Senior等［18］構(gòu)建的腫瘤體內(nèi)模型顯示，與對(duì)照組相比，高表達(dá)的Eph B2顯著減小腫瘤的大小達(dá)10 mm，即使是中等水平的Eph B2的表達(dá)也會(huì)減少大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。Sheng等［19］研究發(fā)現(xiàn) Eph B1在結(jié)直腸中低分化腺癌中高表達(dá)，Eph B1的表達(dá)下調(diào)和結(jié)直腸癌的分化和浸潤(rùn)深度有關(guān)，表達(dá)下調(diào)越明顯，惡性程度越高；表達(dá)下調(diào)的越多，浸潤(rùn)深度越深甚至達(dá)漿膜外脂肪組織。Chiu等［20］提示Eph B3在惡性程度高的結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著下降，研究者將Eph B3轉(zhuǎn)染至HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制。Kumar等［21］發(fā)現(xiàn)敲除Eph B4會(huì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，Eph B4存在調(diào)節(jié)腫瘤的血管發(fā)生和腫瘤細(xì)胞生成的潛力。而筆者最近通過(guò)檢測(cè)Eph B6在結(jié)直腸癌組織及其周圍正常組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Eph B6在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，多見(jiàn)于中晚期病例及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Eph B6在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中可能有一定抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及發(fā)展的作用。

以上實(shí)驗(yàn)證明了Eph B受體與大腸癌的表達(dá)和腫瘤的浸潤(rùn)程度以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤組織的分化程度以及存活率呈正相關(guān)，提示Eph B對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用，提示了Eph B可能是結(jié)直腸癌潛在的抑癌基因。

5 Eph基因是潛在的結(jié)直腸癌治療新靶點(diǎn)

由于Eph基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中可能發(fā)揮一定作用，國(guó)內(nèi)外已有研究人員開(kāi)始將它作為腫瘤生物治療的新靶標(biāo)。Yamaguchi等［22］用Eph A2肽加強(qiáng)型樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療鼠結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)此疫苗可以通過(guò)增加CD8+和CD4+的T細(xì)胞功能發(fā)揮長(zhǎng)效抗腫瘤效應(yīng)。Xia等［23］報(bào)道利用RNA干擾或反義寡核苷酸技術(shù)敲除Eph B4編碼的癌蛋白，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲受到明顯抑制并誘導(dǎo)凋亡。Abéngozar等［24］研究表明，抗 Ephrin B2 治療會(huì)減少小鼠體內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成并降低新生血管的形成，引起血管和淋巴管生成的急劇減少，針對(duì)Ephrin B2的特異性抗體，聯(lián)合現(xiàn)有的抗血管生成藥物，可以作為一種治療癌癥和和血管生成相關(guān)疾病的有效治療手段。Lee等［25］利用在 HT-29人結(jié)直腸癌細(xì)胞株里接種雞胚絨毛尿囊膜，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管生成受到苯基苯乙烯酮的顯著抑制，苯基苯乙烯酮通過(guò)抑制多種RTK受體發(fā)揮抗血管生成及治療癌癥的重要作用。Landen等［26］利用特異性抗體來(lái)中和Eph A2以及小片段干擾性RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Eph A2表達(dá)等方法，配合紫杉類藥物治療卵巢癌等腫瘤，結(jié)果顯示可抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管形成，并提高了患者生存率。目前，大腸癌基因治療的核心問(wèn)題是靶向性，朱役等［27］利用納米材料構(gòu)建載有靶向VEGF mRNA的siRNA質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)納米基因載體具有較高的包封率及轉(zhuǎn)染率，可有效降低大腸癌細(xì)胞株 SW620中VEGF mRNA的表達(dá)量。利用基因技術(shù)，找到個(gè)體不同的致病靶點(diǎn)，采用個(gè)體化的基因治療是大腸癌治療的發(fā)展方向之一。

目前研究證實(shí)Eph基因?qū)S持生物胚胎發(fā)育、調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突導(dǎo)向和控制血管生成等方面都具有重要作用，同時(shí)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中亦發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)外已有很多大腸癌中 Eph表達(dá)譜的研究，有關(guān)Eph在結(jié)直腸癌的基因治療的研究也在不斷深入，但Eph與其配體對(duì)大腸癌的復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，相信隨著有關(guān)研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步，可為進(jìn)一步闡明大腸癌發(fā)生、發(fā)展，包括藥物治療和分子靶向治療提供新的前景。

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