范紅艷，王艷春，顧饒勝，沈 楠，任 曠* (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室;.實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 303)

近年來(lái)隨著工業(yè)化的發(fā)展、人們的生活方式的改變及生存環(huán)境不斷惡化，男性精子質(zhì)量急劇下降，不育癥發(fā)病率日益增多，研究者試圖找到合適的治療男性不育的方法。男性不育癥是臨床上較為常見(jiàn)的性醫(yī)學(xué)疾病之一，導(dǎo)致本病發(fā)生的原因較為復(fù)雜，如陽(yáng)痿、早泄、精液異常(包括精子數(shù)量減少或無(wú)精子、活動(dòng)率低下、畸形率增高及精液液化不良癥等)及不射精癥，其中精液異常所致者約占70% ～80%，故關(guān)于男性不育癥研究的動(dòng)物模型主要以精液質(zhì)量異常性為主。本文將近年來(lái)的生精障礙動(dòng)物模型研究進(jìn)展作一綜述，為男性不育研究和治療藥物開(kāi)發(fā)研究提供一定的參考?，F(xiàn)將各種造模方法介紹如下。

1 物理方法

1.1 熱效應(yīng)致生精障礙模型

哺乳類(lèi)動(dòng)物的睪丸對(duì)熱十分敏感，故大多數(shù)雄性動(dòng)物進(jìn)化的結(jié)果是睪丸生長(zhǎng)在腹腔外或腹腔淺表。睪丸組織局部溫度低于體溫，是精子生成的基本保證，哺乳動(dòng)物陰囊溫度低于正常體溫2～3℃時(shí)，將影響精子的生成。故可利用熱效應(yīng)破壞睪丸與機(jī)體溫差使睪丸溫度升高造成精子生成障礙模型，熱效應(yīng)所致的睪丸功能的損傷程度取決于熱暴露時(shí)間的長(zhǎng)短［1］。

熱效應(yīng)手段一般包括溫水浴、紅外線、激光和超聲波等，其中最簡(jiǎn)單的溫水浴造模方法為:將大鼠陰囊浸沒(méi)于43℃溫水中15 min單次即可得到少精子癥生精障礙大鼠模型［2］。各類(lèi)生精細(xì)胞對(duì)熱效應(yīng)的敏感程度依次為粗線期初級(jí)精母細(xì)胞＞精子細(xì)胞＞細(xì)線前期初級(jí)精母細(xì)胞;A型精原細(xì)胞及支持細(xì)胞所受影響較小。大鼠生精障礙的損傷在熱作用50 d后開(kāi)始恢復(fù)。將猴子陰囊浸沒(méi)于43℃溫水每天30 min，連續(xù)兩天，即可得到少弱精子癥生精障礙猴子模型，睪丸局部熱處理通過(guò)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡使精子數(shù)量減少、活性降低［3］。

激光造模方法為:以連續(xù)輸出的釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光(輸出功率為 7～10 W，波長(zhǎng)為1.06 μm)對(duì)大鼠睪丸進(jìn)行一次性照射，維持局部溫度在(43±0.5)℃，持續(xù)15 min，對(duì)精子發(fā)生迅速產(chǎn)生抗生精效應(yīng)，對(duì)間質(zhì)細(xì)胞功能只產(chǎn)生暫時(shí)影響。

1.2 電離輻射致生精障礙模型

電離輻射的射線具有把能量傳遞給其所通過(guò)組織的特性，輻射的能量可使組織發(fā)生電離作用，包括水和生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)等。睪丸的生殖細(xì)胞對(duì)輻射敏感，可以引起生精上皮損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致精子數(shù)量明顯減少［4］。有研究發(fā)現(xiàn)［5］，對(duì)小鼠骨盆局部照射(5 Gy)，即可損傷小鼠的生精能力。生精細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性依次為:精原干細(xì)胞＞分化的精原細(xì)胞＞精母細(xì)胞＞精子細(xì)胞＞精子。分次照射方式所產(chǎn)生的破壞作用要比單次照射嚴(yán)重，損傷的表現(xiàn)與輻射劑量依賴性、細(xì)胞種類(lèi)和細(xì)胞周期有關(guān)。電離輻射誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡具有明顯的細(xì)胞種類(lèi)規(guī)律性，在較低劑量照射(0.025 Gy)時(shí)，以精原細(xì)胞凋亡為主，隨劑量增加(0.05～0.2 Gy)才逐漸累及精母細(xì)胞，并且精原細(xì)胞凋亡率明顯高于精母細(xì)胞，很少累及精子細(xì)胞和精子。小鼠睪丸具有較強(qiáng)的修復(fù)輻射損傷的能力，一般可部分或完全恢復(fù)生精能力［6］。輻射致暫時(shí)性生精功能損傷后的恢復(fù)時(shí)間隨動(dòng)物種屬和精原干細(xì)胞的存活數(shù)量而異。一般情況下，小鼠恢復(fù)生育的時(shí)間為50 d。

2 化學(xué)方法

2.1 環(huán)磷酰胺致少精子癥模型

環(huán)磷酰胺通過(guò)干擾DNA合成而阻礙生精細(xì)胞的有絲分裂，誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞如精原細(xì)胞和精母細(xì)胞大量凋亡［7］，一般用于小鼠的少精子癥造模，方法有各種劑量長(zhǎng)期喂飼、一次超大劑量腹腔注射和連續(xù)大劑量腹腔注射等，其中較好的方法是連續(xù)大劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺。馮波等人的實(shí)驗(yàn)［8］表明，給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)5 d，生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可在末次給藥后45 d內(nèi)處于顯著低水平。此法的優(yōu)點(diǎn)是周期短、便于造模，但是其作用時(shí)間短，小鼠生精上皮再生速度快，造模后可供研究時(shí)間短，穩(wěn)定性不超過(guò)末次給藥后25 d，不適于連續(xù)性研究，可供選擇的檢測(cè)指標(biāo)有限，使用劑量和作用時(shí)間尚有不確定性。在造模中會(huì)引起10% ～25%的動(dòng)物死亡也是此法的重要缺點(diǎn)。

2.2 白消安致無(wú)精子癥模型

白消安具有特異性地?fù)p傷小鼠生精干細(xì)胞和精原細(xì)胞的作用，從而破壞精子的產(chǎn)生，直接損害生精上皮，減少精子密度，減弱精子活性［9］。腹腔內(nèi)單次注射白消安(40 mg/kg)后小鼠體重減輕，睪丸明顯變小萎縮，曲細(xì)精管失去正常的生精上皮結(jié)構(gòu)，基底膜未見(jiàn)明顯的精原細(xì)胞，用藥后4周，睪丸曲細(xì)精管呈支持細(xì)胞樣表現(xiàn)，3個(gè)月有20%的曲細(xì)精管恢復(fù)生精。故可見(jiàn)，此種小鼠無(wú)精子癥模型也是可逆的。

2.3 白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)合致無(wú)精子癥模型

由于各種單一化學(xué)藥物造模方法均存在各種不同的缺陷(主要是動(dòng)物生精能力的恢復(fù)時(shí)間)，有研究采用［10］白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)合的方法，即給予小鼠一次性腹腔注射白消安10 mg/kg和環(huán)磷酰胺120 mg/kg，注射后第4周睪丸曲細(xì)精管內(nèi)精子、精子細(xì)胞及精母細(xì)胞消失，僅可見(jiàn)少量初級(jí)精母細(xì)胞和精原細(xì)胞;12周時(shí)曲細(xì)精管內(nèi)僅見(jiàn)基底層少許精原細(xì)胞，間質(zhì)組織發(fā)生纖維化;20周時(shí)曲細(xì)精管仍保持無(wú)生精功能的狀態(tài)，無(wú)明顯恢復(fù)跡象，表明此種小鼠無(wú)精子癥模型穩(wěn)定可靠。

2.4 醋酸鉛致無(wú)精子癥模型

鉛對(duì)精子發(fā)育和成熟有干擾和阻礙作用，并對(duì)精子有直接毒性。大量實(shí)驗(yàn)研究表明利用醋酸鉛染毒可建立穩(wěn)定的生精障礙動(dòng)物模型［11］。給予小鼠灌胃醋酸鉛20 mg/kg(連續(xù)染毒5 d)以上時(shí)，精子計(jì)數(shù)、直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、活精子率隨染毒劑量增加而下降，而靜止不動(dòng)精子數(shù)、精子畸形率和初級(jí)精母細(xì)胞染色體畸變率隨劑量增加而升高，可見(jiàn)醋酸鉛染毒大于20 mg/kg時(shí)可損害小鼠的生精功能。

2.5 雌激素致少/無(wú)精子癥模型

雌激素導(dǎo)致雄性動(dòng)物生精功能障礙是經(jīng)典的造模方法。給予雄性SD大鼠炔雌醚(0.33 mg/kg)單獨(dú)或與左炔諾孕酮(0.67 mg/kg)合用7 d，21 d后發(fā)現(xiàn)炔雌醚可干擾生殖細(xì)胞分化，導(dǎo)致精子生成減少、生育能力低下［12］。有研究［13］顯示，青春期前己烯雌酚較大劑量［1.0 ～10.0 μg/(kg·d)×14 d］暴露對(duì)大鼠睪丸發(fā)育及功能有明顯的近期(青春期晚期、性成熟后)和較遠(yuǎn)期 (成年期)毒性作用，該毒性作用隨己烯雌酚的暴露劑量增加而加重，并隨鼠齡增長(zhǎng)而逐漸減退。大劑量雌激素可明顯抑制血清睪酮分泌和精子生成，有研究［10］給予小鼠苯甲酸雌二醇4 mg/kg，連續(xù)注射15 d，注射后第4周，曲細(xì)精管內(nèi)精子、精子細(xì)胞以及部分精母細(xì)胞破壞脫落消失，基底層可見(jiàn)部分精母細(xì)胞和精原細(xì)胞，造成生精功能的損害;注射后12周，曲細(xì)精管內(nèi)可見(jiàn)精母細(xì)胞增多，20周時(shí)部分曲細(xì)精管內(nèi)可以找到精子細(xì)胞和精子，表明部分小鼠睪丸生精功能恢復(fù)，提示此法難以構(gòu)建穩(wěn)定的少/無(wú)精子癥動(dòng)物模型。

2.6 甲醛致少精子癥模型

液態(tài)甲醛和氣體甲醛均具有小鼠生殖細(xì)胞毒性。氣態(tài)甲醛能誘導(dǎo)早期精細(xì)胞微核率增加，均呈現(xiàn)一定的劑量－反應(yīng)關(guān)系。有研究［14］表明甲醛吸入方法給藥(10 ppm/1 h)35 d能引起大鼠精子密度、精子活動(dòng)率和精子數(shù)減少。甲醛(10 mg/kg、30 mg/kg)小鼠腹腔注射，連續(xù)5 d，35 d后可見(jiàn)甲醛能引起精子數(shù)量減少，小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力降低以及小鼠精子畸形率增高。提示甲醛能透過(guò)血睪屏障，干擾精子的生長(zhǎng)、發(fā)育和能量代謝過(guò)程，對(duì)雄性生殖細(xì)胞具有潛在的誘變危害。

2.7 乙醇致少精子癥模型

乙醇是一種確認(rèn)致畸物，母親孕期大量飲酒可致胎兒酒精綜合征，男性酗酒可使性功能減退并引起后代發(fā)育和行為異常。研究表明長(zhǎng)期給予大鼠灌胃乙醇(7.5 g/kg，連續(xù) 13 w)，表現(xiàn)為精子計(jì)數(shù)減少，精子活動(dòng)率下降，精子畸形率明顯升高，精子形態(tài)為某些生精細(xì)胞核固縮、變性，精子細(xì)胞變態(tài)期核固縮，曲細(xì)精管腔中脫落細(xì)胞增多，血清睪酮水平明顯降低，由此可見(jiàn)乙醇會(huì)抑制精子生成和睪酮合成。

3 免疫方法

3.1 實(shí)驗(yàn)性抗精子抗體模型

采用人工免疫方法，將成年雄性Wistar大鼠斷頭處死，取雙側(cè)附睪，調(diào)精子數(shù)為3×109/mL，加入等量福氏完全佐劑混勻作為抗原，給實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)腹股溝皮下多點(diǎn)注射鼠精子抗原作為首次免疫，10 d后于上述相同部位進(jìn)行加強(qiáng)免疫，即可造成AsAb陽(yáng)性模型［15］，可見(jiàn)大鼠精子凋亡率顯著增加。

3.2 實(shí)驗(yàn)性睪丸纖維化模型

采用制造自身免疫性睪丸炎的方法，單側(cè)睪丸內(nèi)注射卡介苗，可建立大鼠睪丸纖維化模型［16］。結(jié)果肉眼可見(jiàn)纖維化睪丸較正常大鼠睪丸明顯縮小，并出現(xiàn)生精細(xì)胞層數(shù)減少，生精細(xì)胞排列紊亂，生精上皮空泡化，生精細(xì)胞脫落、壞死等形態(tài)學(xué)改變。

4 手術(shù)方法

實(shí)驗(yàn)性隱睪模型:20日齡健康雄性SD大鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，開(kāi)腹，切斷一側(cè)睪丸引帶，將該側(cè)睪丸固定于后腹側(cè)壁層，制成單側(cè)隱睪大鼠模型［17］，手術(shù)后7～14 d大鼠睪丸重量減少，生殖細(xì)胞的凋亡率明顯增加［18］?；蚶?0～35日齡小鼠制作實(shí)驗(yàn)性隱睪模型，即將小鼠緊靠腹股溝管處結(jié)扎一側(cè)陰囊，或縫合陰囊口，術(shù)后14 d和21 d后觀察到部分生殖細(xì)胞排列紊亂，曲細(xì)精管則組織結(jié)構(gòu)異常，曲細(xì)精管逐漸萎縮，管腔繼續(xù)增大，生精上皮僅由精原細(xì)胞和一層初級(jí)精母細(xì)胞構(gòu)成，隱睪側(cè)睪丸生精小管直徑逐漸變小，生精細(xì)胞數(shù)明顯減少，初級(jí)精母細(xì)胞分界不清，未見(jiàn)精子細(xì)胞。

5 轉(zhuǎn)基因/基因敲除方法

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)可引起生物體性狀可遺傳的修飾。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中含有外源基因，但由于受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響其有性生殖后代變異較大，難以形成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系，部分動(dòng)物會(huì)發(fā)生精子生成障礙，成為無(wú)精子癥或少精子癥的不育動(dòng)物，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有此方面的報(bào)告［19］。

基因敲除技術(shù)是新的外源性DNA導(dǎo)入技術(shù)，它是基因打靶技術(shù)的一種，類(lèi)似于基因的同源重組，即外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生或糾正精確的基因突變。利用基因敲除方法可以獲得無(wú)精子癥或少精子癥的雄性不育動(dòng)物，研究［20］顯示，Brek基因敲除的小鼠表現(xiàn)為無(wú)精子不育，其圓形精子階段前發(fā)育正常，但不能變形發(fā)育為長(zhǎng)形精子。故轉(zhuǎn)基因/基因敲除動(dòng)物的穩(wěn)定性和普及還有待繼續(xù)研究。

6 展望

目前建立的生精障礙動(dòng)物模型均存在一定的不足，如化學(xué)方法在對(duì)生精功能損傷的同時(shí)，對(duì)機(jī)體其他系統(tǒng)的功能也會(huì)造成損傷、模型的穩(wěn)定性欠佳等，因此研究者也不斷在改良生精障礙動(dòng)物模型上積極探索。本文對(duì)于生精障礙動(dòng)物模型的總結(jié)，希望對(duì)男性生殖方面的藥理研究提供一定的幫助。

［1］Yarmolenko P S，Moon E J，Landon C，et al.Thresholds for thermal damage to normal tissues:an update［J］.Int J Hyperthermia，2011，27(4):320－343.

［2］Kheradmand A，Dezfoulian O，Tarrahi M J.Ghrelin attenuates heat－induced degenerative effects in the rat testis［J］.Regul Pept，2011，167(1):97－104.

［3］Liu Yixun，Li Xixia.Molecular basis of cryptorchidism－induced infertility［J］.Sci China Life Sci，2010，53(11):1274－1283.

［4］Chuai Yunhai，Gao Fu，Li Bailong ，et al.Hydrogen－rich saline attenuates radiation－induced male germ cell loss in mice through reducing hydroxyl radicals［J］.Biochem J，2012，442(1):49－56.

［5］Kim J S，Heo K，Yi J M，et al.Genistein Mitigates Radia－tion－induced Testicular Injury［J］.Phytother Res，2012，26(8):1119－1125.

［6］Hacker－Klom U B，Kǒhnlein W，Gǒhde W.Effects of single and split doses of cobalt－60 gamma rays and 14 MeV neutrons on mouse stem cell spermatogonia［J］.Radiation research，2000，154(6):667－672.

［7］Hales B F，Aquilar－Mahecha A，Robaire B.The stress response in gametes and embryos after paternal chemical exposures［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2005，207(2 Suppl):514－520.

［8］馮 波，申吉泓，袁彬彬，等.小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺建立少精子癥模型的穩(wěn)定性探討［J］.中華男科學(xué)雜志，2007，13(1):71－73.

［9］Pérez－Crespo M，Pericuesta E，Pérez－Cerezales S，et al.Effect of liver growth factor on both testicular regeneration and recovery of spermatogenesis in busulfan－treated mice［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9(1):21.

［10］黃勛彬，李紅鋼.小鼠無(wú)精子癥動(dòng)物模型的構(gòu)建［J］.中華男科學(xué)雜志，2007，13(2):147－149.

［11］Sainath S B，Meena R，Supriya Ch，et al.Protective role of Centella asiatica on lead－induced oxidative stress and suppressed reproductive health in male rats［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2011，32(2):146－154.

［12］Liu Ming，Wan Xinrong，Yin Yimeng，et al.Subfertile effects of quinestrol and levonorgestrel in male rats［J］.Reprod Fertil Dev，2012，24(2):297－308.

［13］李和程，陳 琦，王子明，等.青春期前己烯雌酚暴露對(duì)SD大鼠睪丸發(fā)育及功能的影響［J］.中華男科學(xué)雜志，2008，14(2):142－148.

［14］K?se E，Sars?lmaz M，Tas U，et al.Rose oil inhalation protects against formaldehyde－induced testicular damage in rats［J］.Andrologia，2012，44(Suppl 1):342－348.

［15］溫海霞，張淑芹，邊淑玲，等.抗精子抗體陽(yáng)性大鼠精子凋亡及機(jī)制的研究［J］.中國(guó)男科學(xué)雜志，2005，19(5):5－7.

［16］王 濤，馬毓梅，修賀明，等.大鼠睪丸纖維化模型的建立［J］.中華男科學(xué)雜志，2002，8(4):266－269.

［17］Shikone T，Billig H，Hsueh A J.Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis［J］.Biol Reprod，1994，51(5):865－72.

［18］Hou Wugang，Hu Jing，Li Yan，et al.Altered expression of NDRG2 in the testes of experimental rat model of cryptorchidism［J］.Urology，2010，75(4):985－91.

［19］何迎春，田道法，江志超，等.轉(zhuǎn)基因雄性小鼠不育原因分析［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22(1):19－20.

［20］Nakamura T，Yao R，Ogawa T，et al.Oligo－astheno－teratozoospermia in mice lacking Cnot7，a regulator of retinoid X receptor beta［J］.Nature genetics，2004，36(5):528－533.