方 娟，陳朝銀，* ，趙聲蘭，劉迪秋，葛 峰

(1.昆明理工大學，生命科學與技術(shù)學院，云南昆明650500;2.云南中醫(yī)學院，云南昆明650500)

全球有高達6%的兒童和2%的成年人有食物過敏，并呈上升趨勢［1-3］。其中兒童過敏原主要來自牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆，成人過敏原主要來自花生、食物堅果、魚貝［4］。因此，1999 年WHO、FAO 決定對包含已知過敏原的八大類食物進行標記［5-7］。2008 年北京奧運會期間，中國政府也要求對加工食品中所含主要過敏原或者由過敏原衍生而來的成分進行標示［8］。在所有食物過敏原中堅果類食物占了90%的比例，其中核桃產(chǎn)生的過敏反應在所有植物堅果中約占34%。全球有0.2%～0.7%的人口受到核桃和其它植物堅果過敏的困擾［8-10］。15%的兒童過敏體質(zhì)者對核桃過敏［11］。核桃過敏患者在攝食核桃及其制品可能出現(xiàn)多種不良反應，主要表現(xiàn)在呼吸道、胃腸道、皮膚等綜合性臨床癥狀，如惡心、嘔吐、嘴唇紅腫等，嚴重時會導致休克甚至死亡［4，12-14］。這些癥狀不僅對過敏癥患者的身心健康構(gòu)成威脅，而且還極大影響其生活質(zhì)量。限制攝食核桃過敏原是防止核桃過敏的有效途徑。但由于核桃使用的廣泛性，完全避免食入核桃過敏原極為困難。因此，歐美等發(fā)達國家為了更好地保護食物過敏人群，以立法的方式規(guī)定食品生產(chǎn)商要在產(chǎn)品標簽上標明食物過敏原。顯而易見，與之相適應的核桃過敏原檢測技術(shù)的發(fā)展意義重大，核桃過敏原的檢測可為核桃過敏癥患者的安全消費提供重要的技術(shù)支撐。

1 核桃主要過敏原

目前為止，世界過敏原數(shù)據(jù)庫(http://www.allergenonline.org)共收錄了6 種核桃過敏原，根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異，主要分為2S 白蛋白(Juglans Jug r 1，Jug n 1)，7S 豌豆球蛋白類似蛋白(Juglans Jug r 2，Jug n 2)，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Juglans Jug r 3)，11S豆球蛋白類似蛋白(Juglans Jug r 4 seed storage protein)［7，15］。

1.1 Juglans Jug r 1

在所有核桃過敏原中研究最多的是英國核桃中的Juglans Jug r 1，一種2S 白蛋白種子儲存蛋白，是核桃中引起過敏反應最主要的一種過敏原。該2S白蛋白富含精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸，可溶于水和低濃度鹽溶液。該蛋白共由139 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為15～16ku，核桃中的2S 白蛋白與其他植物堅果，如巴西堅果、棉籽、蓖麻豆、芥末中的2S 白蛋白在氨基酸序列上有非常重要的同源性。同時，跟很多來源不同的2S 白蛋白一樣，Juglans Jug r 1也是一種前體蛋白，可以在生化反應中分裂為一個大亞基和一個小亞基［15］。目前，在大量研究基礎(chǔ)上，許多過敏免疫療法都是基于對位于有活性的免疫球蛋白E 上面氨基酸的詳細掌握。近幾年，已成功利用分子生物學方法對一些產(chǎn)生變態(tài)反應的核桃過敏原如Juglans Jug r 1 進行克隆和表達［16-18］。

1.2 Juglans Jug r 2

對Juglans Jug r 2 研究較多的是英國核桃中的7S 豌豆球蛋白類似蛋白，同樣也是核桃過敏原之一。該蛋白由593 個氨基酸組成，分子量約為44ku，以三聚體低聚體形式存在。該蛋白存在于諸多植物種子中，但迄今為止，只有花生、大豆、核桃中的該蛋白會對過敏癥患者產(chǎn)生免疫反應，并且Juglans Jug r 2 與花生過敏原中的Ara h 1 在序列和蛋白組成上均呈現(xiàn)75%的同源性［19］。Suzanne S.Teuber 等［19］于1999年成功利用分子生物學的方法對核桃中的過敏原Juglans Jug r 2 進行克隆和表達，并通過分析病人的血漿發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他植物堅果類蛋白，如豌豆球蛋白、花生蛋白、可可子蛋白呈現(xiàn)出極小的交叉反應。

1.3 Juglans Jug r 3

核桃過敏原除了Juglans Jug r 1 和Juglans Jug r 2 之外，由Elide A.Pastorello 等［9］人于2004 年發(fā)現(xiàn)英國核桃中第三種能引起嚴重過敏反應的蛋白--脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，后提交到國際免疫學會免疫原命名委員會，命名為Juglans Jug r 3。該蛋白分子量為9ku。研究人員通過分析核桃過敏癥患者的血液發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠與免疫球蛋白E 大量結(jié)合，但是迄今為止Juglans Jug r 3 還沒有被成功克隆出來，對于免疫球蛋白E 上面抗原表位的氨基酸序列還沒有清楚的研究。

1.4 Juglans Jug r 4

第四種英國核桃過敏原是11S 豆球蛋白類似蛋白(Juglans Jug r 4 seed storage protein)，已被成功克隆和表達，11S 球蛋白在植物堅果中是一種很重要的潛在過敏原，在植物萌芽階段扮演氮源提供者的重要角色［20］。

1.5 Juglans Jug n 1 和Jug n 2

Juglans Jug n 1 和Jug n 2 是黑核桃(Juglans nigra)中的兩種過敏原，分別為2S 白蛋白和豌豆球蛋白，與Juglans Jug r 1 和Juglans Jug r 2 分別有96%和97% 的同源性。二者相對分子質(zhì)量分別為19、56ku［10］。

2 檢測核桃過敏原的主要方法

由于過敏原在食物中含量較低，且易被食物基質(zhì)包裹，導致食物中過敏原的檢測比較困難，所以需開發(fā)靈敏、有效的方法檢測過敏原。

食物過敏原檢測方法既可以基于蛋白，也可以基于DNA。前者包括電泳、色譜、質(zhì)譜和免疫學方法，如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等;后者主要采用各種PCR 方法，如Real-time PCR(實時熒光定量PCR)、Multiplex-PCR(多重PCR)和RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應)等。針對核桃過敏原，目前研究最多、應用最廣泛的是測定蛋白的ELISA 法和測定DNA 的PCR 法。

2.1 ELISA 法

ELISA 法是目前最常見的過敏原免疫分析方法，具有特異性高、敏感性強和準確性高等優(yōu)點。歐盟、美國、加拿大和日本等已實施過敏原法規(guī)標準的國家和地區(qū)，都推薦和認同ELISA 法為標準過敏原檢測方法。ELISA 法能連續(xù)檢測大量樣品并保持高水平的敏感性，是檢測特異性蛋白的一種經(jīng)典、實用的檢測手段。最近幾年，有許多針對核桃過敏原的ELISA 檢測方法的研究，研究較多的是夾心ELSIA 法。

2.1.1 夾心ELISA 法 夾心ELISA 是常見的ELISA檢測方法，主要用來檢測大分子蛋白。由于在核桃過敏原中Juglans Jug r 1 是最主要的一種過敏原，不少學者選擇其來制備抗體進而建立檢測核桃過敏原的ELISA 方法，并取得成果。比如，Hirotoshi Doi等［7］在2008 年通過從核桃中分離純化得到的單一蛋白--2S 白蛋白(Juglans Jug r 1)對兔進行免疫實驗從而制備多克隆抗體，并利用化學方法對多抗進行標記，進而利用雙抗夾心ELISA 法對加工食品中的核桃過敏原進行分析檢測，回收率可達到83.4% ～123%，批間差異和批內(nèi)差異分別控制在8.8% 和7.2%以內(nèi)，交叉反應實驗表明該抗體除了跟美洲山核桃有較嚴重交叉反應之外跟其他堅果并無明顯交叉反應。實驗結(jié)果證實該夾心ELISA 可以較好應用于加工食品中潛在過敏原的檢測，為過敏癥患者免遭過敏反應的折磨提供了保障。

隨著試劑盒開發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展，核桃過敏原檢測相關(guān)試劑盒已經(jīng)被成功開發(fā)生產(chǎn)并投入商業(yè)化應用。2010 年日本森永生物制品研究所利用Juglans Jug r 1 作為抗原、制備血清、建立夾心ELISA 法，進而成功開發(fā)核桃蛋白試劑盒，Shinobu Sakai 等［3］人與多個實驗室聯(lián)合對其進行全方位評估，回收率達到81%～119%，批間差異小于6%，批內(nèi)差異在5.8%～9.9%之間，標準曲線R2可達到0.999 以上，證實了該試劑盒的可用性。

在選擇過敏原方面，有的研究人員選擇單一蛋白作為免疫原，有的選擇核桃混合蛋白。混合蛋白免疫原可以制備出含有諸多抗原位點的抗體，可最大程度上與抗原及待檢樣品結(jié)合，較準確的對潛在過敏原定性檢測，但是定量檢測方面不如單一蛋白制備的抗體有優(yōu)勢［21］。

Lynn Niemann 等［2］選擇生熟兩種核桃蛋白混合物作為免疫原，對山羊和綿羊兩種動物進行免疫，從而制備多抗，建立三抗夾心ELISA 方法。該方法對于核桃的最低檢測限達到1ppm，回收率71.6% ±7%～119% ±16.5%，通過對100 余種植物堅果進行交叉反應后的實驗結(jié)果來看，該抗體與美洲山核桃有較嚴重交叉反應，與榛子、芥末、罌粟種子有輕微交叉反應，與其他植物堅果均無交叉反應。商業(yè)產(chǎn)品應用實驗中的41 種產(chǎn)品，除了12 種標簽明確標明含有核桃蛋白的產(chǎn)品中能檢測到過敏原的存在之外，在另外29 種沒有標明含有核桃的產(chǎn)品中有3 種被檢測到含有該過敏原，雖然含量較低，但卻增加了敏感個體的產(chǎn)生過敏反應的風險，再次證明該方法可用于核桃過敏原的檢測。

2.1.2 間接競爭ELSIA 法 王海艷等［22］選擇核桃總蛋白作為免疫原，利用間接競爭ELSIA 法對核桃過敏原進行檢測，回收率78% ～93%，定量檢測限為94ng/mL，交叉反應結(jié)果表明，除美洲山核桃蛋白與胡桃蛋白有很強的交叉反應，與其他植物堅果交叉反應率均小于0.01%。

核桃過敏原檢測中關(guān)于ELISA 方法的研究，夾心法研究應用較多，主要因為夾心ELISA 方法比競爭ELSIA 和間接ELSIA 具有更多優(yōu)勢，不僅可以提高檢測的靈敏度，同時也提高檢測準確度。同樣，以單一蛋白作為抗原制備抗體建立的ELSIA 法相比混合蛋白抗原制備抗體建立的ELSIA 方法在準確度和靈敏度上都更勝一籌。通過多名研究人員建立的ELSIA 方法的交叉反應結(jié)果來看，美洲山核桃無疑是最易與核桃產(chǎn)生交叉反應的一種植物堅果，從而導致ELSIA 法檢測核桃過敏原時美洲山核桃對結(jié)果的嚴重干擾，原因可能為兩種核桃中的過敏原在氨基酸序列上有較高的同源性。該結(jié)果同樣也為核桃過敏原的檢測和標簽說明提供依據(jù)。

2.2 聚合酶鏈式反應(PCR)

PCR 技術(shù)是近些年才運用于食物中過敏原的檢測，目前報道能夠成功應用于核桃過敏原檢測的PCR 方法有傳統(tǒng)PCR 和Real-time PCR［23-24］。這種基于DNA 的方法相對于基于蛋白質(zhì)的方法有很多優(yōu)勢，最明顯之處是食物基質(zhì)中目標DNA 的降解速度要比蛋白質(zhì)慢很多，不會導致過敏原的變性，從而保證了檢測結(jié)果的準確性［23，25］。

2.2.1 傳統(tǒng)PCR 傳統(tǒng)PCR 方法操作簡便、省時、對儀器設備要求較低，特異性強。Takeo Yano 等［23］于2007 年利用該方法成功檢測核桃過敏原，發(fā)現(xiàn)核桃mat K 基因是其基因組中特異性最強的基因，當研究人員檢測含有胡桃和美洲山核桃基因的鮭魚整個基因組時，胡桃、美洲山核桃基因均能被檢測到，且PCR 檢測量為0.5pg，結(jié)果顯示核桃與美洲山核桃中都含有mat K 基因。該結(jié)果可解釋通過建立ELSIA方法檢測核桃過敏原交叉反應實驗中為何美洲山核桃與制備的抗體有嚴重交叉反應。但是，美洲山核桃并沒有被歸類到核桃家族中。最后，他們通過尋找除了二者共有的酶切位點Acll 之外，核桃基因中所特有的酶切位點Bfal，成功將核桃和美洲山核桃區(qū)分開來，很大程度上提高了傳統(tǒng)PCR 方法的靈敏度和準確度。這一結(jié)果表明該方法不僅可以成功應用于檢測食品中的核桃過敏原，而且還較好的解決了普通PCR 可能帶來結(jié)果不可靠、有交叉污染等問題，避免了新型PCR 方法需要昂貴儀器的弊端，為檢測食品中核桃過敏原DNA 成分奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

雖然該方法可以成功應用于對核桃過敏原的定性檢測，但還無法達到定量檢測的水平，而Real-time PCR 便可以解決該問題。

2.2.2 實時熒光定量PCR(Real-time PCR) Realtime PCR 技術(shù)于1996 年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，而且與傳統(tǒng)PCR 相比，它具有特異性強、有效解決PCR 污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

Brezna 等［24］通過Real-time PCR 方法檢測食物中的核桃主要過敏原Jug r 2 基因成分，檢測限為0.24ng 核桃DNA。研究人員檢測13 種食物樣品，值得注意的是，其中兩種樣品被檢測到含有核桃過敏原，但是在食品標簽中卻沒有標明，這就大大增加了過敏癥患者的過敏幾率，從而對部分消費者的生命健康構(gòu)成威脅。WANG Haiyan 等同樣采用Realtime PCR 方法對核桃過敏原進行檢測，檢測限為0.00125ng 核桃DNA，且除了核桃檢測結(jié)果為陽性，其它植物堅果包括美洲山核桃均為陰性，比起之前的研究結(jié)果特異性更強、靈敏度更高［9］。

2.3 其它

生物傳感器在食品檢驗中的應用已相當廣泛，包括食品工業(yè)生產(chǎn)在線監(jiān)測、食品成分分析、食品添加劑分析、有毒有害成分分析、感官指標及一些特殊指標(如食品保質(zhì)期)的分析［24］。在食品安全檢測方面應用較多的是免疫傳感器［25-26］。具有靈敏度高、檢測下限低、分析時間短、分析過程簡單、設備小型化、測量過程自動化等優(yōu)點［27］。目前，已有用該方法檢測到食物中的過敏原，如Singn 等［28］就用納米生物傳感器成功檢測了花生過敏原Ara h 1，Wang Wei等［29-30］建立聯(lián)合PCR 技術(shù)和生物傳感器連續(xù)檢測大豆過敏原的方法并成功應用。

質(zhì)譜法也在許多食物過敏原檢測中有所應用，如Chassaigne 等［31］就采用了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成功檢測到花生中的主要過敏原蛋白Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4。Careri 等［32］采用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)檢測花生過敏原Ara h 2 和Ara h 3/4，檢測限分別為2.2μg/g 和5μg/g，回收率分別為86% ±18%和110% ±4%，都能很好的檢驗出花生過敏原。盡管生物傳感器法和質(zhì)譜法目前還沒有成功檢測核桃過敏原的報道，但理論上均有可能被應用到核桃過敏原的檢測中。

3 結(jié)語

對于過敏患者，飲食上嚴格控制核桃蛋白的攝入是避免核桃過敏反應唯一有效的途徑。對于核桃食品過敏原的標識和質(zhì)檢，目前尚局限于ELSIA 法和PCR 法，雖然在準確性和靈敏度上能夠滿足檢測需求，但仍然不夠快速和低成本。且ELISA 方法還易與美洲山核桃產(chǎn)生嚴重交叉反應，PCR 方法既費時又需要昂貴實驗設備，因此急需研究人員對以上方法進行改進。生物傳感器、質(zhì)譜法等一些新型、快速、靈敏且準確精細的過敏原檢測［26-29］方法的開發(fā)應用有待進一步探索。

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