趙 林，石興耀

(上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海嘉定 201800)

P27kip1蛋白作為抑癌基因近年來被廣泛研究，并被認為是一種腫瘤標志物及預后因子［1］。作為細胞周期素依賴蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inbibitor，CDKI)家族的重要成員之一，P27kip1具有廣泛的生物活性，不僅可以抑制腫瘤生長導致其凋亡，還可以調控腫瘤對于藥物的耐受以及預防炎癥對組織的損傷。一旦P27kip1蛋白表達降低或缺失時，細胞由G期進入S期失去調節(jié)，細胞的增殖將不受控制，基因發(fā)生變異，從而導致腫瘤形成［2］。我們對手術切除的結直腸癌組織及癌旁組織中 P27kip1進行檢測，探討P27kip1在結直腸癌組織中的表達差異，并分析其與患者預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集嘉定區(qū)中醫(yī)院外科2008年4月至2011年12月手術切除的結直腸癌62例，患者術前未接受任何新輔助治療，男33例，女29例;年齡45～82歲，平均55.6歲(標準差8.81歲)。結腸26例，直腸36例;高分化32例，中分化18例，低分化14例;根據UICC標準TNM分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期12例(根據術前檢查行根治或姑息性手術治療)。所有病人予以電話或門診隨訪，隨訪時間5～52個月，平均21.9個月(標準差12.3個月)。同時選擇正常大腸黏膜20例作為對照。

1.2 實驗方法

采用免疫組織化學S-P法測定手術標本中癌組織及癌旁組織的P27kip1蛋白表達，在各步驟中嚴格控制溫度和時間。所有操作由經過培訓的2名病理科醫(yī)師進行。P27kip1單抗購自上海太陽生物技術有限公司。

1.3 結果判定

P27kip1陽性著色在細胞核、部分細胞質內可表達。細胞核和(或)細胞質中呈棕黃色染色為陽性細胞，每張切片均由2位有經驗的病理科醫(yī)生在相同條件下觀察，每視野計數200個細胞，共1 000個細胞。P27kip1陽性結果判斷標準［3］:陽性細胞占總計數細胞比例＜10%為陰性，＜50%為低表達(+)，≥50%為高表達(++)。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義，用卡方檢驗進行P27蛋白的表達和臨床病理資料的統(tǒng)計學分析，用Kaplan-meier進行生存單因素分析，COX比例風險模型進行多因素分析。

2 結果

2.1 P27kip1在結直腸癌組織、癌旁組織及正常組織的表達

P27kip1陽性著色在細胞核、部分細胞質內可表達。162例結直腸癌的癌旁組織中P27kip1均有表達，其中高表達39例，高表達率為62.9%，而癌組織中P27kip1表達陽性為43例，陽性率為69%，高表達率為37%，兩組高表達率有明顯差異性(P=0.004)。但癌旁組織與正常組織中的P27kip1表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.321)。見表1、圖1。

表1 P27kip1在結直腸癌組織、癌旁組織及正常組織的表達

2.2 P27kip1表達與臨床病理特征的關系

P27kip1的表達水平與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化無明顯關聯(lián)(P＞0.05)，但與腫瘤的臨床病理分期(TNM分期法)和淋巴結轉移有關聯(lián)，腫瘤病理分期越晚，P27kip1的表達越弱;在淋巴結轉移病例的癌組織中P27kip1的表達也較低(表2)。

表2 P27kip1表達與臨床病理特征的關系

2.3 生存分析

在接受根治性手術的62例患者中，P27kip1高表達的患者共20例，隨訪發(fā)現復發(fā)及死亡的3例，低表達的38例，復發(fā)及轉移的15例，P27kip1高表達病人的腫瘤復發(fā)率和死亡率均顯著低于P27kip1低表達者(P=0.044)。

通過Kaplan-meier檢驗對P27kip1進行生存單因素分析，提示P27kip1高表達的病人生存時間較長(P=0.035)，然而通過COX比例風險模型進行多因素分析，沒能提示P27kip1的表達能作為獨立預測生存的因素(P＞0.05)，見圖2。

3 討論

P27kip1是一種細胞周期調節(jié)因子，通過調定活化細胞周期素依賴性激酶所需的細胞周期素E的閾值來抑制細胞增生［4-5］。P27kip1目前被公認為是一種抑癌基因，其編碼的P27kip1蛋白具有限制性調節(jié)細胞周期進程作用，這一作用主要是通過抑制cyclin-CDK復合物功能來實現的。研究發(fā)現，P27kip1雖然可抑制各種cyclin-CDK復合物蛋白激酶活性，但在體內，P27kip1主要與cyclinD1、CDK4以及cyclin E-CDK 2復合物結合，將細胞阻斷于G1期，使之不能進入s期。越來越多的研究表明幾乎所有人類腫瘤均伴隨P27kip1下調或缺失［6］。Anderson等的研究表明，P27kip1基因表達與腫瘤的分化程度以及腫瘤的TNM分期有關，P27kip1的表達水平高低還影響腫瘤的浸潤程度及腫瘤細胞的凋亡［7］。Tsukamoto等［8］在 16 個 NSCIC 的切除后標本中檢測P27kip1表達水平，并進行追蹤調查，結果發(fā)現P27kip1低表達者5年存活率為35.4%，明顯低于高表達者的63.2% ，可以看出，對于已行外科手術切除的NSCLC患者，癌組織的P27kip1表達水平可以作為預后的生物學指標。

本研究結果顯示，P27kip1的表達與年齡、性別、腫瘤部位、病理分化，在統(tǒng)計學上無明顯差異，在腫瘤的分期及淋巴轉移上有顯著相關性，腫瘤分期越晚，P27kip1的表達越低，提示可能通過對P27kip1的檢測，來判斷患者的預后情況［9］。最近的研究發(fā)現，P27與腫瘤的發(fā)展機制可能與Skp2-P27kip1通路有關，P27作為Skp2(S-phase associated kinase protein2)作用的底物與Skp2一起在許多惡性腫瘤中表達異常，Skp2可降解P27，從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展［10］;另外，P27kip1中存在多種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，其中位于外顯子編碼區(qū)的Vall09Gly多態(tài)性為有義突變。P27Val109Gly基因多態(tài)性較純合性P27更易降解，細胞內P27的含量便急劇下降。細胞內P27含量減少使細胞周期G1期到s期過渡失控，從而引起或促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。

在生存分析的統(tǒng)計結果中，P27kip1高表達組的生存時間要長于低表達組，有統(tǒng)計學意義，但COX比例風險模型進行多因素分析的結果提示P27kip1不能作為一個獨立的預后預測指標，這與Claudio等［12］的研究結果并不一致。結合臨床考慮，所有術后的病人均有接受不同程度的放化療及中醫(yī)中藥治療，這些治療均可能延緩病人的生存期，因此可能干擾了本研究的研究結果。我們反思，自身研究的臨床要素并不一定是能夠對預后評價作出一錘定音的評價效應，若能反應部分的生物效應對臨床研究亦有益處，而對于腫瘤疾病的發(fā)展，也應該是由多重因素相互制約協(xié)同的結果，更多的認識，應該通過更多的研究和臨床循證來證明，此外，樣本量及隨訪時間不夠，也可能是制約實驗結果的因素。

我國結直腸癌的發(fā)生率呈直線上升趨勢，作為早期手術治療療效較為滿意的一類腫瘤疾病，對于疾病預后往往成為病患及醫(yī)務工作者的關注重點，檢測結直腸癌組織中的P27kip1蛋白表達水平可以較為合理的評估病人病情及預后，并有助于臨床篩選高復發(fā)轉移可能的病人，目前已有研究表明對P27kip1基因修飾后可抑制腸道的腫瘤生長［13］，相信不久的將來，對于結腸癌的基因治療，P27kip1將作為有效分子參與其中。

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