張秀才，吳巖斌，吳錦玉，吳建國(guó)，李 芹，林玉明，梁一池，吳錦忠

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福州市傳染病醫(yī)院，福建 福州350025；3.福州佳樂達(dá)生物工程有限公司，福建 福州350001）

金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的新鮮或干燥全草，是多年生珍稀中草藥，具有清熱涼血，祛風(fēng)利濕功效［1］，用于治療肺結(jié)核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無(wú)力、遺精、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥［2-3］。金線蓮主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)及大洋洲，我國(guó)主要分布于東南沿海地區(qū)，以福建、臺(tái)灣居多［4］。近年來(lái)隨著人為采挖，野生金線蓮資源逐年減少，大量人工組織培養(yǎng)金線蓮涌現(xiàn)市場(chǎng)?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明：金線蓮主要含有黃酮類、糖類、生物堿類、甾體類、三萜類和氨基酸等成分［5-8］，具有降血糖、降血壓、抗氧化、保肝、抗炎、抗菌和鎮(zhèn)痛等生物活性［8，9］，金線蓮黃酮類成分是重要有效成分之一［6］。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)金線蓮品質(zhì)，有必要建立金線蓮黃酮含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法，考察不同因素水平對(duì)總黃酮提取率的影響，以總黃酮含量為指標(biāo)，進(jìn)行回流提取工藝研究，優(yōu)化其工藝參數(shù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材 金線蓮由福州佳樂達(dá)生物工程有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃澤豪副教授鑒定，標(biāo)本保留在福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院。

1.2 試劑 異槲皮苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11121801）；亞硝酸鈉（上海三鷹化學(xué)試劑有限公司，AR）；硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠，AR）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）

1.3 儀器AB204-N電子天平（METTLER TOLEDO上海公司）；雙列四孔數(shù)顯水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SH2-D（Ш）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB-5/25℃低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備［10］精密稱取干燥至恒重的異槲皮苷對(duì)照品10mg置50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1mL中含異槲皮苷0.2mg）。精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置25mL容量瓶中，各加水至6.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白，在紫外-可見分光光度下200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行一元線性回歸。

2.2 供試品溶液的制備 稱取干燥的金線蓮0.5g，精密稱定。按L9（34）正交設(shè)計(jì)表，加熱回流提取，過濾，合并濾液，45℃真空減壓濃縮至干，加適量無(wú)水甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用無(wú)水甲醇定容至10mL，作為供試品溶液。

2.3 金線蓮總黃酮的含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液1mL置25mL容量瓶中，照“2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下的方法，自“加水至6.0mL”起，依法測(cè)定吸光度。計(jì)算總黃酮提取率（以生藥量計(jì)）。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以總黃酮百分含量為指標(biāo)，采用回流提取法，考察乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選，用L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取工藝條件。因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取金線蓮3份，按最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，得到3份提取液，按2.2供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，自“45℃真空減壓濃縮至干”起，制備成供試品溶液；按2.3金線蓮總黃酮的含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)定總黃酮含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收峰 光譜掃描結(jié)果表明：在510 nm處有最大吸收峰。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程 以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，異槲皮苷濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程。其線性回歸方程為：Y＝0.01707X－0.00495（r2＝0.99991），其中，X為異槲皮苷溶液濃度，Y為吸光值。表明異槲皮苷濃度在8～48mg/L范圍內(nèi)，吸光度值與濃度呈良好線性關(guān)系。結(jié)果見表2、圖1。

表2 不同濃度異槲皮苷的吸光值

圖1 異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 正交試驗(yàn)最佳提取條件 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析結(jié)果，見表3。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，極差中D項(xiàng)最大，A項(xiàng)最小，即該4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響程度大小為：D＞C＞B＞A。表明在該條件下，各因素對(duì)金線蓮總黃酮提取率影響的主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞乙醇濃度。因乙醇濃度極差最小，故以乙醇濃度為誤差列，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析表

由表4方差分析結(jié)果可知，4個(gè)因素均對(duì)金線蓮總黃酮提取率無(wú)顯著性影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮多種因素，提取金線蓮總黃酮最佳工藝為A3B3C3D3，即20倍量的95%乙醇回流提取3次，每次90 min。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步確證該工藝的穩(wěn)定性和合理性，按最佳提取工藝條件，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5知，金線蓮總黃酮提取率平均值為1.837%，RSD為1.91%，結(jié)果表明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

4 討 論

近年來(lái)，福建省金線蓮產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅猛，2011年以來(lái)，在福建省種植業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程“金線蓮等藥用蘭科植物產(chǎn)業(yè)化示范與推廣項(xiàng)目”帶動(dòng)下，福建省金線蓮逐步進(jìn)入更快、更好地發(fā)展，并形成了以漳州南靖為中心，向閩中、閩西和閩北等地區(qū)放射性發(fā)展的趨勢(shì)。

中藥化學(xué)成分有多種的提取方法，其中主要是溶劑回流提取法或結(jié)合超聲和微波的提取法。溶劑回流提取法操作簡(jiǎn)便，提取效率高，而且儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，為一般藥材質(zhì)量檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室所必備，尤其適用于金線蓮生產(chǎn)企業(yè)對(duì)金線蓮質(zhì)量檢測(cè)。建立溶劑回流提取金線蓮黃酮類成分，對(duì)金線蓮生產(chǎn)企業(yè)規(guī)范金線蓮生產(chǎn)質(zhì)量及其生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制訂提供依據(jù)。

金線蓮黃酮類成分提取效率受到多因素的影響，如料液比、提取溶劑及其濃度、提取次數(shù)和提取時(shí)間等，提取效率直接影響其含量測(cè)定結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)基于單因素對(duì)金線蓮黃酮類成分提取率影響，采用正交實(shí)驗(yàn)4因素3水平，優(yōu)選金線蓮總黃酮的最佳提取工藝，并利用該最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該提取方法操作簡(jiǎn)單可行，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，為金線蓮生產(chǎn)企業(yè)提供金線蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

［1］黃有霖．福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］．福州：海風(fēng)出版社，2006：154．

［2］福建省中醫(yī)藥研究院．福建藥物志：第2卷（修訂本）［M］．福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1994：492-493．

［3］《全國(guó)中草藥匯編 》編寫組．全國(guó)中草藥匯編［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：392-393．

［4］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委．中國(guó)植物志：第17卷［M］．北京：科學(xué)出版社，2000：204．

［5］龔秀會(huì)，許敏，董鴻竹，等．不同基原金線蓮植物的化學(xué)成分比較研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（36）：17530-17531．

［6］何春年，王春蘭，郭順星，等．福建金線蓮的化學(xué)成分研究［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（8）：581-582．

［7］關(guān)璟，王春蘭，郭順星．福建產(chǎn)金線蓮中黃酮苷成分的研究［J］．中草藥，2005，36（10）：1450-1453．

［8］張紅艷，潘馨．金線蓮化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］．海峽藥學(xué)，2009，21（1）：82-84．

［9］唐健，鄧元榮，卓?jī)x榮．金線蓮的藥理活性研究進(jìn)展［J］．海峽藥學(xué)，2008，12（20）：77-79．

［10］耿紅梅，張彥，曹麗慧，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選白花菜子總黃酮的最佳提取工藝［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（4）：886-887．