陳 友 ，胡佳娟 ，陳忠蔭，陳勇敢

(1 瓊州學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海南 三亞 572022;2 三亞市第二中學(xué)，海南 三亞 572000)

海南是我國野生靈芝資源最非富的分布地［3］，在野生靈芝資源的利用中占據(jù)著舉足輕重的地位，而野生靈芝的馴化研究是資源利用中不可或缺的一環(huán).因此，選擇兩種尖峰嶺野生靈芝，黃邊靈芝(Ganoderma luteomarhinatum)和咖啡網(wǎng)孢芝(Humphreya coffeatum)作為材料，以瓊州學(xué)院栽培靈芝培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對其一級、二級、三級種的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 實驗材料 供試材料是兩株生長于海南省尖峰嶺地區(qū)不同原生境的野生靈芝.實驗將黃邊靈芝(Ganoderma luteomarhinatum)編號4-3，將咖啡網(wǎng)孢芝(Humphreya coffeatum)4-5，文中都將以編號表示.

1.2 實驗方法

1.2.1 一級種(又稱母種)培養(yǎng) 按照實驗要求準備該實驗所需材料.具體配方見表1.其中1/2MS、1/4MS 和1/10MS 培養(yǎng)基是分別將標(biāo)準MS 培養(yǎng)基稀釋至2 倍、4 倍和10 倍后加入培養(yǎng)基中.

首先配制培養(yǎng)基:按表1 配方稱量PDA 各原料的1/10，加水、溶解、定溶、滅菌、分平板，其次接種:最后對生長速度進行測量計算，通過數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計分析，確定兩種靈芝各自最佳的生長配方.最后以最佳者為一級種接種到二級培養(yǎng)基上進行培養(yǎng).

1.2.2 二級種的培養(yǎng) 按照實驗要求做好前期準備，根據(jù)表1 的配方配制好所需培養(yǎng)基(Y1004、Y1005、Y1006、Y1008).裝袋、滅菌，待溫度降至室溫后接種.然后對生長速度進行測量計算:將培養(yǎng)瓶置于25.C 的培養(yǎng)房內(nèi)培養(yǎng)并適時記錄菌絲的生長高度.長滿后，分別以時間、高度作為依據(jù)計算各靈芝種在不同培養(yǎng)基下的生長速度，分析、比較，取其最佳者選之.最后，以最佳者菌種為二級種接種到三級培養(yǎng)基.

1.2.3 靈芝三級種的制種與培養(yǎng) 三級種的步驟基本同二級種，培養(yǎng)基配方編號分別為Y3101、Y3102，具體培養(yǎng)基配方詳見表1，本次采用袋裝培養(yǎng)法，三級種接種于育種袋內(nèi).

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對靈芝一級種生長的影響 由表2 可知，菌種編號為4-3 的靈芝其一級種在培養(yǎng)基PDA+1/4MS 上的生長速度最佳，即PDA+1/4MS 為4-3 一級種最優(yōu)培養(yǎng)基配方，而編號4-5 中培養(yǎng)基PDA+1/2MS 和PDA+1/4MS 上的菌絲生都很好.綜合4-3 和4-5 的一級種菌絲生長情況，可以得出配方為PDA+1/4MS 培養(yǎng)基為一級種的最優(yōu)培養(yǎng)基配方.

表1 靈芝一、二、三的培養(yǎng)基配方

表2 不同培養(yǎng)基對靈芝一級種生長的影響

圖1 不同培養(yǎng)基中靈芝一級種菌絲生長狀況

2.2 不同二級種培養(yǎng)基對所選靈芝生長的影響 由表3 可知，菌種編號為4-3、4-5 的靈芝其二級種均在培養(yǎng)基Y1005 上具有最佳生長速度，且相對于其他培養(yǎng)基它所產(chǎn)生的菌絲密度大、長勢佳.綜合比較菌絲密度、長勢.Y1005 為該種的二級種最佳培養(yǎng)基配方.所以，均以Y1005 培養(yǎng)基上的菌落作為菌種接種到三級種培養(yǎng)基上.

表3 不同培養(yǎng)基對靈芝二級種生長的影響

圖2 不同培養(yǎng)基中靈芝二級種菌絲生長情況

2.3 不同三級種培養(yǎng)基對所選靈芝生長的影響 由表4 可知，菌種編號為4-3、4-5 的靈芝其三級種均在培養(yǎng)基Y3102 上具有最佳生長速度，參照圖3，可見其菌絲濃密，長勢良好;在培養(yǎng)基Y3101 上前期長勢良好，后出現(xiàn)生長停滯現(xiàn)象，黃化現(xiàn)象明顯.所以三級種的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為Y3102.

表4 不同培養(yǎng)基對靈芝二級種生長的影響

圖3 不同培養(yǎng)基中靈芝二級種菌絲生長情況

2.4 結(jié)果分析

2.4.1 根據(jù)以上三點結(jié)果顯示，一級種最優(yōu)培養(yǎng)基為PDA+1/4MS(具體配方見論文中)，其4-3 的菌絲生長速度為1.7036 mm/d、4-5 的菌絲的生長速度為2.5298mm/d.篩選出二級種的最優(yōu)培養(yǎng)基為Y1005(具體配方見論文中)，其4-3 的菌絲生長速度為4.3750 mm/d、4-5 的菌絲生長度為4.0000 mm/d.篩選出三級種的最優(yōu)培養(yǎng)基為Y3102(具體配方見論文中)，其4-3 的菌絲生長4.3478 mm/d、4-5 的菌絲生長速度為4.0293 mm/d，

2.4.2 實驗結(jié)果表明，菌種編號為4-3 和4-5 的靈芝其一級種在培養(yǎng)基PDA+1/4MS 上的生長速度都很好，此配方既適合不同的野生種，因此，這種配方可以作為其它野生靈芝一級種的首選配方.而根據(jù)編號為4-5 靈芝其一級種在培養(yǎng)基PDA +1/2MS 上具有最佳生長速度，這即說明不同種質(zhì)的野生靈芝一級種的配方可能還不相同，可以在此種配方的基礎(chǔ)下再進行優(yōu)化.

2.4.3 所選兩種靈芝均在Y1005 培養(yǎng)基上的具有最佳長勢，綜合考慮其經(jīng)濟成本，Y1005 在實際生產(chǎn)中可采納應(yīng)用.

2.4.4 主料中添加麥麩等含氮量高的輔料會明顯提高靈芝產(chǎn)量，且麥麩添加量為20 %時產(chǎn)量最高［7］.4-3、4-5 靈芝均在Y3102 黃豆粒培養(yǎng)基中生長速度快、菌絲濃密，這是由于黃豆粒較松散，菌絲生長速度快，故滿瓶時間短、長勢佳.

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