李歡歡 黃丙倉， 許曉嵐 武剛

(1.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院放射科，上海 201700，2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院醫(yī)學影像科，上海 200135)

本研究應(yīng)用氫質(zhì)子磁共振波譜(1H-magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)觀察大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型經(jīng)針刺治療后病灶局部腦代謝物的變化規(guī)律，以探討1H-MRS在評價針刺治療腦缺血疾病中的實用價值［1］。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 手術(shù)器械:眼科剪、顯微剪、彎剪、眼科彎鑷、直鑷、止血鉗、玻璃分針、動脈夾、大鼠解剖臺及固定繩、自制拉鉤、圓針、三角針、手術(shù)用0號及4號線、華佗牌1.5寸毫針。MCAO栓線(直徑為0.26 mm)購自北京沙東生物技術(shù)有限公司。碘附消毒液、10%水合氯醛、青霉素溶液為本實驗室配制。

1.2 研究方法

1.2.1 MCAO模型的構(gòu)建 健康雄性SD大鼠60只，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(實驗動物質(zhì)量合格證號:0946490)。標準飲食，自由進水，飼養(yǎng)至體質(zhì)量250～300 g。采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為模型組(n=27)、針刺組(n=27)和假手術(shù)組(n=6);再按照磁共振成像(MRI)檢查時段將模型組和針刺組分為3個亞組:24 h、3 d、7 d，每個亞組9只。MCAO模型構(gòu)建:首先，10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，待大鼠處于麻醉狀態(tài)時，將其仰臥位固定于解剖臺上，剪去頸部鼠毛，碘附消毒。取頸部正中線作約2 cm的縱行切口，上至下頜骨平面，下至胸骨柄上緣，玻璃分針分離右側(cè)頸前肌群，顯露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)，并將其與伴行的迷走神經(jīng)分離，在頸CCA下方穿線備用，提拉穿線向上分離右側(cè)頸外動脈(external carotid artery，ECA)、右側(cè)頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，在 ICA分叉處將 ECA結(jié)扎，并在ICA遠心端下方穿線備用，用兩把止血鉗提拉備用線兩端，交錯放置，暫時夾閉ICA，用顯微剪在距CCA分叉部4 mm處斜行剪一小切口，用眼科鑷順勢將備好的栓線經(jīng)切口插入，當栓線標記接近ECA和ICA分叉處插入深度約18 mm時，緩慢推線遇阻力停止，將CCA下方的備用線與栓線近心端一并結(jié)扎，剪斷各結(jié)扎線殘端，縫合皮膚，切口處滴青霉素溶液2～3滴，腹腔注射2 mL 0.9%氯化鈉液，然后將大鼠放回籠中。假手術(shù)組手術(shù)操作步驟基本同上，只結(jié)扎右側(cè)CCA及ECA，不插入線栓。

1.2.2 MRI參數(shù)及后處理方法 采用Philips Intera Achieva 1.5T超導MR成像系統(tǒng)，并用EWS影像后處理工作站處理圖像，4通道大鼠專用線圈。大鼠麻醉后俯臥位，頭置于線圈中央，毛巾覆蓋體表保溫。行常規(guī)橫斷位SE序列T1WI、T2WI掃描，DWI檢查后行 H-MRS。MRS:點分辨自旋回波波譜(point-resolved spectroscopy，PRESS)，刺激回波采集樣式(stimulated echo acquisition mode，STEAM)，采用二維多體素波譜分析序列，在T2橫斷位像上定位，置于大腦中動脈供血區(qū)層面(包括梗死區(qū)及其周圍區(qū))，體素容積為3 mm×3 mm×3 mm，掃描前自動勻場，采集時間為8 min。在右側(cè)梗死區(qū)周圍選取5～8 mm2感興趣區(qū)，統(tǒng)計該區(qū)域的各代謝物波峰下面積。

1.2.3 穴位選取與針刺方法 參照動物穴位定位圖譜［2］，選擇大鼠百會穴、太陽穴。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，待大鼠進入麻醉狀態(tài)，用1.5寸毫針頭穴透刺法(百會透太陽)行針刺，留針30 min，留針期間每隔10 min提插捻轉(zhuǎn)行針1 min，每隔24 h針刺一次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布采用兩樣本t檢驗，非正態(tài)分布采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗;兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCAO模型的建立及大鼠偏癱癥狀的變化本研究中建立的大鼠MCAO模型左肢均有不同程度的活動障礙。模型組死亡4只，術(shù)中死亡1只，24 h內(nèi)死亡1只，3 d內(nèi)死亡2只;針刺組死亡3只，24 h內(nèi)死亡1只，3 d內(nèi)死亡2只;死亡大鼠24 h MRI檢查均見梗死區(qū)面積較大。死亡大鼠相應(yīng)時段數(shù)據(jù)缺失，其余大鼠可見肢體活動狀況隨時間延長和針刺治療得到相應(yīng)的改善。

2.2 常規(guī)T2WI表現(xiàn) T2WI及對應(yīng)MRS成像結(jié)果見圖1。T2WI示，模型組24 h亞組和針刺組24 h亞組大鼠的右側(cè)基底節(jié)及額頂葉皮質(zhì)區(qū)信號較對側(cè)鏡像區(qū)明顯增高，局部腦溝回變淺呈現(xiàn)腦腫脹的改變;模型組3 d亞組栓塞區(qū)T2WI信號與24 h亞組比較，差異無統(tǒng)計學意義;針刺組3 d亞組栓塞區(qū)T2WI信號與24 h亞組比較，差異也無統(tǒng)計學意義，兩亞組在造模7 d后栓塞區(qū)T2WI高信號范圍較24 h亞組和3 d亞組有縮小趨勢，假手術(shù)組T2WI未見明顯異常信號。

2.31H-MRS 檢測結(jié)果

2.3.1 假手術(shù)組 假手術(shù)組腦組織MRS波形同正常腦組織磁共振波譜曲線，N-乙酰天門冬氨酸(N-acetyl aspartate，NAA)峰最為明顯;肌酸(creatine，Cr)、膽堿復合物(choline，Cho)峰曲線下面積相近;乳酸(lactate，Lac)峰大部分未見，小部分為倒置雙峰，波峰下面積明顯低于NAA、Cr、Cho。兩側(cè)相應(yīng)部位腦組織代謝物無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 造模后各組常規(guī)T2WI表現(xiàn)及MRS成像

2.3.2 模型組及針刺組1H-MRS檢測結(jié)果 模型組和針刺組的24 h亞組、3 d亞組均見梗死周圍區(qū)NAA濃度持續(xù)下降，7 d亞組NAA濃度有所上升;模型組24 h亞組和針刺組24 h亞組NAA濃度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.5);針刺組3 d亞組和針刺組7 d亞組NAA濃度較模型組明顯升高(31.43±2.88比 25.90 ±3.48，60.84 ±2.76 比 54.31 ±1.40;均 P＜0.05)。模型組和針刺組的24 h亞組的Lac濃度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);針刺組3 d亞組和針刺組7 d亞組Lac濃度較模型組明顯降低(58.82±3.78 比 65.15 ±3.58，50.22 ±4.33比 55.46 ±4.06;均 P ＜0.05)，見圖 2、表1。Cho、Cr濃度隨著缺血時間延長有不同程度升高，但模型組與針刺組各時段亞組濃度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表2)。

圖2 模型組與針刺組各時段亞組NAA與Lac濃度的變化

表1 模型組及針刺組各時段亞組NAA和Lac濃度比較()

表1 模型組及針刺組各時段亞組NAA和Lac濃度比較()

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表2 模型組及針刺組各時段Cho和Cr濃度比較()

表2 模型組及針刺組各時段Cho和Cr濃度比較()

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3 討 論

MRS是利用磁共振現(xiàn)象和化學位移原理對特定原子核及其化合物進行分析的無損傷性研究活體組織生化代謝的一種技術(shù)。不同化合物中相同原子的進動頻率不同，故可在MRS頻率軸的不同位置形成不同的代謝峰，其峰下面積反映不同化合物濃度，可用積分法進行定量分析。近年來對1H-MRS研究顯示［3］，1H-MRS可檢測的腦組織的代謝產(chǎn)物主要有 NAA、Lac、Cho和 Cr。NAA 在約2.0 ppm 時發(fā)生共振，可以作為反映神經(jīng)元功能狀況的內(nèi)標物，NAA降低提示神經(jīng)元和突觸的損失及功能異常。Lac在約1.33 ppm處呈倒置雙峰，它為糖酵解的最終代謝產(chǎn)物，可反映無氧酵解的情況，正常腦組織磁共振波譜中一般不會有Lac峰。當腦缺血、氧供減少、無氧酵解率增加時，Lac含量亦增加［4］。Cho峰出現(xiàn)于約3.2 ppm處，可反映腦內(nèi)總膽堿的儲藏量，其含量增加可能是細胞合成或分泌量增加的反映。Cr峰見于約3.03 ppm處，是能量代謝的一種產(chǎn)物，通常將Cr作為參照波峰，進行半定量分析。

NAA幾乎僅存在于成熟腦組織的神經(jīng)細胞中，被認為是神經(jīng)病理狀態(tài)的生化標志，因腦組織壞死而存活的神經(jīng)元數(shù)量減少會導致NAA降低，但并不是NAA降低的必然因素，因為僅有腦功能失調(diào)而無神經(jīng)元死亡也可引起NAA的顯著丟失［5］。Lac是早期缺血的敏感指標，腦缺血早期即可出現(xiàn)Lac峰，Lac峰的出現(xiàn)通常早于NAA峰的下降，但檢測到Lac并不預示著一定是梗死，有時非梗死區(qū)域也可檢測到少量Lac［6］。本研究證明，模型組和針刺組梗死區(qū)周圍主要代謝產(chǎn)物的總體變化是一致的，均在24 h檢測到NAA下降、Lac升高，之后NAA在7 d時回升，Lac在3 d時逐漸回落，但模型組和針刺組在不同時間其主要代謝物在量上有差異，3 d和7 d時針刺組NAA濃度較模型組高，而Lac濃度較模型組低;同時，大鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)也逐漸好轉(zhuǎn)，7 d時多數(shù)大鼠已無明顯的肢體運動障礙，而且針刺組的神經(jīng)功能評分優(yōu)于模型組，證明針刺對腦梗死的治療作用是通過促進梗死灶神經(jīng)元的再生和調(diào)節(jié)局部代謝實現(xiàn)的。關(guān)于Cho和Cr，不同研究得到的結(jié)論不同［7］，Gillard 等［8］認為，腦梗死一段時間內(nèi)，膽堿復合物及肌酸升高，升高的區(qū)域多見于梗死的病灶，反映了細胞磷脂膜結(jié)構(gòu)和髓鞘的崩解及能量代謝的異常。Saunders等［9］的臨床研究則顯示，膽堿復合物在梗死28 h內(nèi)變化不明顯。在亞急性期和慢性期膽堿復合物的濃度升高，且這與梗死灶膠質(zhì)增生、梗死灶部分修復有關(guān)。本研究中模型組與針刺組Cho、Cr濃度在檢測的各時段均較假手術(shù)組有不同程度升高，但模型組與針刺組之間差異無統(tǒng)計學意義，說明腦梗死后Cho、Cr升高，但針刺的調(diào)節(jié)作用不明顯。假手術(shù)組雙側(cè)NAA、Cho、Cr無明顯變化，部分檢測到少量Lac，說明一側(cè)頸總動脈和頸外動脈的結(jié)扎對腦缺血代謝物的影響不大，機體可以通過基底動脈環(huán)和其他側(cè)支循環(huán)的生理性代償來改善腦缺血的狀況。

應(yīng)用磁共振波譜成像觀察大鼠大腦中動脈閉塞針刺治療效果時，應(yīng)注意以下幾個方面:(1)線栓法的原理是機械式阻塞造成局灶性腦缺血，其發(fā)病過程與人群自發(fā)的腦梗死有一定差異;(2)針刺組大鼠行針刺均在其麻醉狀態(tài)下進行，針刺療效必然會受到麻醉藥物的影響;(3)每次針刺的手法力度不同可能會導致結(jié)果的差異，因此需保證同一人施針，手法力度保持一致;(4)數(shù)據(jù)處理中ROI大小均為手動調(diào)節(jié)，故每次測量存在誤差，ROI的選擇應(yīng)避開骨質(zhì)和血腫等影響磁場均勻性的部位，并盡量減少腦脊液部分容積效應(yīng)影響和灰白質(zhì)之間的差異。

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