Mrie Thérèse Bidj Aben，謝觀蓮，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)a.生物與環(huán)境工程學(xué)院;b.國(guó)際學(xué)院，杭州 310032)

石油是目前環(huán)境中廣泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、潤(rùn)滑油、石蠟和瀝青等，由多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳烴)和少量其他有機(jī)物組成。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對(duì)能源的需求不斷擴(kuò)大，石油已成為人類最主要的能源之一。隨著石油產(chǎn)量和需求的不斷提高，冶煉、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)泄漏所造成的水體、土壤和大氣等環(huán)境污染更加突出。石油進(jìn)入土壤后與土粒粘連，土壤結(jié)構(gòu)被破壞，降低土壤的透氣性和滲水性［1］。目前，國(guó)內(nèi)外石油污染土壤修復(fù)技術(shù)按其性質(zhì)可分為3種:物理方法、化學(xué)方法和生物方法。石油污染的生物修復(fù)，是指利用處理系統(tǒng)中生物(主要是微生物)的代謝活動(dòng)來(lái)減少污染現(xiàn)場(chǎng)污染物的濃度或使其無(wú)害化的過(guò)程，其最終產(chǎn)物是CO2、H2O等物質(zhì)［2］。與物理、化學(xué)修復(fù)技術(shù)相比，具有多種優(yōu)點(diǎn)［3］:成本低;對(duì)人和環(huán)境造成的影響小;污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受許多因素的影響，如溫度，pH值，營(yíng)養(yǎng)物，氧，培養(yǎng)基組成，污染物的濃度和生物利用度［4］。關(guān)于石油類降解微生物已有一些報(bào)道，但符合實(shí)際應(yīng)用要求的菌株還有待不斷地開(kāi)發(fā)和研究。為研究適合非洲本土環(huán)境的石油類降解微生物，研究從來(lái)自喀麥隆未受柴油污染土壤中，篩選分離出高效柴油降解酵母，分析了影響其降解能力的幾種因素，為進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的來(lái)源

降解柴油的菌株從來(lái)自喀麥隆的土壤中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)［5］:NH4Cl 1g，K2HP041g，Na2SO42g，MgS04·7H20 1g，CaCl2·6H2O 0.01g，蒸餾水 1L，pH=6.0，121℃高壓蒸汽滅菌 20min。

無(wú)機(jī)鹽含柴油固體培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，瓊脂15～20 g，柴油 1 mL。

查氏固體培養(yǎng)基(Czapek agar medium):K2HPO41 g;KCl0.5g，蔗糖 30g，F(xiàn)eSO40.01g;MgSO40.5g，NaNO32g，蒸餾水1L，pH 6.8，瓊脂15 ～20g，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.1.3 儀器

UV-1000紫外分光光度計(jì);雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床;Agilent Technologies 6890-5975氣相色譜—質(zhì)譜法聯(lián)用儀等。

1.2 方法

1.2.1 柴油降解菌株的篩選與鑒定

柴油降解菌株的篩選:吸取1 mL土壤懸液涂布于查氏固體培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)后，為進(jìn)一步利用將菌株在40%甘油-20℃保存。將甘油保藏菌重新轉(zhuǎn)接到以柴油為唯一碳源的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，30℃，180rpm搖床培養(yǎng)5d，待培養(yǎng)基變混濁后，用無(wú)機(jī)鹽含柴油固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將純化菌株于試管斜面培養(yǎng)后4℃保藏。

柴油降解菌株的鑒定:對(duì)分離得到的柴油降解菌株應(yīng)用5.8SrDNA-ITS序列分析進(jìn)行酵母的分子鑒定，結(jié)合傳統(tǒng)的鑒定方法，根據(jù)微生物的形態(tài)特征和生理生化特征，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》［6］及相關(guān)文獻(xiàn)，最終將菌株鑒定到屬。酵母總DNA提取，用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母的DNA。用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，體系總體積為50μL。采用通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)［7］擴(kuò)增供試菌株的 ITS1-5.8SrDNA-ITS片段，送至上海英俊生物技術(shù)公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并用軟件MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 柴油降解率的測(cè)定

將柴油配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL 溶液于10 mL 容量瓶中，用正己烷稀釋定容。分別倒入石英比色皿中，以正己烷作空白對(duì)照在紫外分光光度計(jì)中在254nm波長(zhǎng)下測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將試驗(yàn)中的萃取液在10 000r/min，4℃下高速冷凍10min。稀釋定容后測(cè)定萃取吸光度。根據(jù)回歸計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=4.820x-0.001(R2=0.999)，其中 y 表示吸光度，x表示柴油質(zhì)量濃度，R2表示相關(guān)系數(shù)。

柴油降解率的計(jì)算:柴油的降解率=(初始柴油濃度-殘余柴油濃度)/初始柴油濃度×100%

1.2.3 影響柴油降解因素的研究

在裝有50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的250mL三角瓶加入1mL柴油，2mL種子液(4.6×108cells/mL)。測(cè)定不同的溫度(20℃、30℃、和37℃)、pH 值(分別為6、7、8、9 和10)、不同的氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和NH4Cl，濃度均為1 g/L)，以及添加不同濃度的鼠李糖脂 (10 g/L、20 g/L和60g/L)對(duì)柴油降解的影響，同時(shí)設(shè)置了空白試驗(yàn)，即除不加菌株外其余條件保持一致，在180r/min恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)9d，檢測(cè)柴油降解并確定優(yōu)化降解條件。

1.2.4 氣相色譜—質(zhì)譜法聯(lián)用儀設(shè)置

分別提取培養(yǎng)0d，5d，9d后的殘油1ul，按照之前描述過(guò)的方法進(jìn)行GC/MS分析［8］。載氣為He，載氣總流量為1 mL/min;進(jìn)樣模式為分流;進(jìn)樣口溫度:250℃;檢測(cè)器接口溫度:250℃;柱箱溫度:60℃，保持2min，以20℃/min升至300℃，保持5min;電離方式:EI;電離能:70eV;掃描模式:全掃描;掃描質(zhì)量范圍:41～500amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴油降解菌株的鑒定

分別采用常規(guī)的土壤稀釋法和平板涂布法從來(lái)自喀麥隆地區(qū)的土壤中分離出一高效柴油降解菌株，在含柴油平板和搖瓶中都能很好地生長(zhǎng)。將菌接入液體柴油無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)2d后，培養(yǎng)基開(kāi)始逐漸變成乳白色，浮在液面上的柴油逐漸減少。通過(guò)稀釋涂平板，最終得到一株能利用石油烴的酵母菌，命名為KML。將篩選出的進(jìn)行菌體形態(tài)特征，菌落圓形，乳白色，大小為1.7-4.2×2.3-7.7μm。菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 柴油降解菌株的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain KML

對(duì)該菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以酵母5.8S rDNAITS通用引物，擴(kuò)增到358bp的DNA片段，GenBank登錄號(hào)為JX420122。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示該菌株于解脂耶羅維亞酵母的序列同源性最高。選出9種同源性較高的序列，利用MEGA5.0的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖1所示，該菌株與Yarrowia lipolytica Y25(EU603297)位于同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育的分支。

圖1 基于5.8SrDNA－ITS構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain KML based on the 5.8SrDNA －ITSgene sequence

2.2 降解影響因素的研究

2.2.1 初始pH對(duì)降解率的影響

由圖2(A)可知，菌株對(duì)pH值有較廣泛的適應(yīng)范圍，pH從6～10均具有比較好的適應(yīng)性。但在pH為9時(shí)降解率最高，達(dá)到75.1%。一般適合酵母生長(zhǎng)的pH環(huán)境是偏酸的，在有的研究中，pH 6.0時(shí)柴油降解率最大［9］。而在吳蘭等人的研究中，游離解脂耶羅維亞酵母在初始pH 6～10范圍內(nèi)對(duì)色拉油都有著較好的降解效果，降解率維持在60%以上，表明解脂耶羅維亞酵母能很好地適應(yīng)中性偏堿的環(huán)境［10］。

2.2.2 溫度對(duì)降解率的影響

由圖2(B)可以看出，該菌株KML對(duì)柴油降解的適宜溫度在20℃ ～37℃范圍內(nèi)，溫度在30℃降解率最高達(dá)到59.0%，在37℃時(shí)降解率最低，只有41.0%。溫度對(duì)降解率的影響主要表現(xiàn)在兩方面:一是影響石油烴降解菌的生長(zhǎng)速度;二是影響油的物理狀態(tài)和化學(xué)組成［11］。低溫時(shí)，由于某些對(duì)微生物有毒害的低分子量石油烴類在低溫下難揮發(fā)，石油黏度升高，會(huì)對(duì)石油烴類的降解有一定的抑制作用，同時(shí)酶活力也降低，所以低溫下石油烴類較難降解［12］。隨著溫度的上升，烴的代謝增加，高溫引起的烴化合物膜毒性增加，使得溫度對(duì)生物的新陳代謝過(guò)程起了相反的作用，抑制了石油烴類的微生物降解。

2.2.3 不同的氮源對(duì)降解率的影響

由圖3(A)可知，添加酵母膏后降解效果最佳，降解率接近77%。微生物的生長(zhǎng)繁殖需要碳、氫、氧、磷和其他各種礦物質(zhì)元素［13］。石油污染物含有大量的碳和氫，是微生物可以利用的底物，但它只能夠提供有機(jī)碳而不能提供其他營(yíng)養(yǎng)物。因此，氮源和磷源是常見(jiàn)的烴類生物降解限制因素，添加適量營(yíng)養(yǎng)物可以促進(jìn)生物降解。

2.2.4 不同的鼠李糖脂濃度對(duì)降解率的影響

圖2 初始pH和溫度對(duì)降解率的影響Fig.2 Effects of initial pH(A)and temperature(B)on the percentage of diesel oil degraded

圖3 氮源和鼠李糖脂對(duì)降解率的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources(A)and rhamnolipid(B)on the percentage of diesel oil

從圖3(B)可以看到，在添鼠李糖脂濃度10mg/mL時(shí)降解率達(dá)到最高，為78.0%。但隨著濃度的增大，降解率有所下降，這表明表面活性劑對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用。少量的表面活性劑會(huì)促進(jìn)柴油的降解。因?yàn)榧尤氡砻婊钚詣┛梢詾榫w提供一個(gè)既親水又親油的界面，一方面使柴油易于和菌體接觸，另一方面能降低油—水界面張力，使柴油變?yōu)榧?xì)小油滴，對(duì)汽油產(chǎn)生顯著的協(xié)同增溶作用，構(gòu)成乳液，增加柴油的生物可利用性，使擴(kuò)散進(jìn)入菌體細(xì)胞，加速汽油的降解［14］。

2.2.5 GC －MS 分析結(jié)果

圖4表示對(duì)降解后(第5d和第9d后)剩下的柴油進(jìn)行了分析，探求生物降解后石油烴組分的變化。如圖分別是培養(yǎng)前后(5d和9d后)培養(yǎng)基中柴油的GC－MS圖譜。經(jīng)過(guò)5d和9d后，柴油鏈烴含量有所下降，主要降解了C9～C25的直鏈烴和少量支鏈烴，最后只剩下了一些不飽和烴。

圖4 柴油組分氣相色譜—質(zhì)譜圖Fig.4 GC －MSanalysis of diesel components

3 結(jié)論

本研究在以柴油為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基中篩選出柴油降解菌株KML，經(jīng)鑒定，該菌株為解脂耶羅維亞酵母。對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)一步考察，在溫度為30℃、pH為9、添加酵母膏(1g/L)和鼠李糖脂濃度(10g/L)的條件下，降解率可提高到78%。通過(guò)GC－MS組分分析，該菌主要降解C9～C25的長(zhǎng)鏈烴和少量支鏈烴。由此可知，KML是株有應(yīng)用潛力的柴油降解菌。

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