冀頤之，趙有璽，龔 平，王群群，譚天偉

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.北京化工大學(xué)教育部生物煉制工程中心，北京100029）

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶）是一類能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長鏈脂肪酸的酶類（或此反應(yīng)的逆反應(yīng)）。除催化水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)外，脂肪酶還能催化酯交換反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)、醇解反應(yīng)、酸解反應(yīng)以及氨解反應(yīng)等多種化學(xué)反應(yīng)。具有嚴(yán)格的底物專一性、催化活性高而副產(chǎn)物少、催化過程不需要輔助因子等特點[1]。根霉屬（Rhizopus sp.）脂肪酶具有高度的1、3位置專一性，由于其特別適用于含油脂食品的增香、芳香酯及其他酯類的合成和某些手性化合物的拆分等方面，因此受到了眾多研究者和企業(yè)研發(fā)部門的關(guān)注[2]。霉菌深層發(fā)酵時菌體形態(tài)復(fù)雜，而菌體形態(tài)又顯著的影響著發(fā)酵過程中的傳質(zhì)、溶氧，因此發(fā)酵過程中對于菌體形態(tài)的有效控制是發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素。研究表明若條件控制不好，根霉菌體易聚集成團(tuán)塊狀，引起氧氣及其他營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞困難，導(dǎo)致整體發(fā)酵水平較低[3-5]。無載體固定化方法又稱為自聚集法，是一種利用細(xì)胞自聚集特性形成固定化顆粒的技術(shù)，其具有不使用載體材料、技術(shù)簡便，成本低廉等優(yōu)點，是固定化細(xì)胞技術(shù)中的全新概念，有著良好的應(yīng)用前景[6]。目前，脂肪酶的固定化發(fā)酵多采用載體固定化方式[7]，無載體固定化根霉的研究僅見于有機酸發(fā)酵中[8-9]，而在脂肪酶生產(chǎn)中還未見報道。發(fā)酵培養(yǎng)基成分對脂肪酶生產(chǎn)有著非常顯著的影響[10-12]。研究報道脂肪酶的產(chǎn)生依賴于碳源、氮源、誘導(dǎo)劑、無機鹽等多種培養(yǎng)基成分，由于生產(chǎn)菌株及所產(chǎn)脂肪酶的特性不同，因此其最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基也不相同。對于無載體固定化少根根霉發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶而言，培養(yǎng)基成分不僅影響脂肪酶產(chǎn)量，還影響著菌體形態(tài)，因此適宜的培養(yǎng)基配方有利于提高根霉菌體的固定化效果。論文擬通過單因子和正交實驗對影響無載體固定化少根根霉生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行研究，以獲得最佳培養(yǎng)基配方，進(jìn)一步提高脂肪酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

少根根霉（Rhizopus arrhizus）N-103 為本實驗室保存菌種；斜面種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基 葡萄糖15g/L，酵母粉1g/L，（NH4）2SO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.75g/L，NaCl 0.5g/L，去離子水1000mL，pH8，250mL三角瓶裝液量為100mL；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 花生油5mL/L，全脂豆粉15g/L，（NH4）2SO41g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.5g/L，pH 自然，250mL三角瓶裝液量為100mL。

超凈工作臺 北京君合華科技發(fā)展有限公司；霉菌培養(yǎng)箱MJX型 金壇市城東久久實驗儀器廠；臺式恒溫振蕩器THZ-D 江蘇太倉實驗設(shè)備廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6 金壇市科興儀器廠；生物傳感分析儀SBA-40C型 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面種子培養(yǎng) 26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。

1.2.1.2 無載體固定化少根根霉的制備 接入發(fā)酵液的孢子終濃度在3×105個/mL，26℃恒溫?fù)u床，130r/min，培養(yǎng)24h。

1.2.1.3 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)條件 接種種齡24h，接種量10%、26℃恒溫?fù)u床，130r/min，培養(yǎng)72h。

1.2.2 單孢子懸液的制備 將30mL生理鹽水倒入斜面中，用接種鉤將斜面上少根根霉孢子全部刮下，經(jīng)2層無菌擦鏡紙過濾至帶有10顆玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩，將孢子打散，再以2層無菌擦鏡紙過濾，去除殘余菌絲體，獲得的孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×106個/mL備用。

1.2.3 脂肪酶活力的測定 采用橄欖油乳化法測定[13]。在37℃，pH7.0下每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸所需脂肪酶的量，即為1個脂肪酶國際單位，以U表示。聚乙烯醇橄欖油乳化液5mL和0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液4mL，加入1mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品，37℃精確反應(yīng)10min。加入95%乙醇20mL終止反應(yīng)，以酚酞為指示劑，用50μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定至微紅為終點，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，同時以在酶反應(yīng)前加入乙醇的實驗組作空白對照。同一樣品進(jìn)行3組平行實驗，分別計算其脂肪酶活力，實驗結(jié)果以3組數(shù)據(jù)平均值表示。

式中：VA—樣品消耗NaOH溶液體積（mL）；VB—空白樣品消耗NaOH溶液體積（mL）；N—NaOH溶液濃度（μmol/mL）；F—樣品稀釋倍數(shù)；V—參加反應(yīng)的樣品體積（mL）；t—反應(yīng)時間（min）。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化實驗

1.2.4.1 不同種類誘導(dǎo)劑對產(chǎn)酶影響的實驗 選擇油酸、大豆油、花生油、橄欖油為誘導(dǎo)劑，分別以5ml/L的濃度加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，考察不同種類誘導(dǎo)劑對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.2 不同花生油含量對產(chǎn)酶影響的實驗 將花生油分別以2.5、5、10、20、30mL/L的濃度加入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，考察不同花生油含量對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.3 不同種類碳源對產(chǎn)酶影響的實驗 選擇葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽浸粉、糊精、麩皮多糖水解液、玉米淀粉水解液、碎米水解液、白糠水解液為碳源，以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組，考察不同碳源對產(chǎn)酶的影響。其中葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽浸粉、糊精以5g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，麩皮多糖水解液、玉米淀粉水解液、碎米水解液、白糠水解液以其葡萄糖含量5g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中。

1.2.4.4 不同麩皮多糖水解液含量對產(chǎn)酶影響的實驗 將葡萄糖含量為50g/L的麩皮多糖水解液分別以0、25、50、75、100mL/L的含量加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，考察不同麩皮多糖水解液含量對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.5 不同種類有機氮源對產(chǎn)酶影響的實驗 選擇全脂豆粉、豆粕粉、大豆蛋白、豆餅粉、小麥胚芽蛋白、棉籽蛋白作為有機氮源，分別以15g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，考察不同種類有機氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.6 不同棉籽蛋白含量對產(chǎn)酶影響的實驗 將棉籽蛋白分別以10、15、20、25g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，考察不同棉籽蛋白含量對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.7 不同種類無機氮源對產(chǎn)酶影響的實驗 選擇（NH4）2SO4、NH4CL、（NH4）2HPO4、NH4NO3作為無機氮源，分別以1g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，考察不同無機氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.8 不同（NH4）2SO4濃度對產(chǎn)酶影響的實驗 將（NH4）2SO4分別以1、2、3、4g/L的濃度加入已優(yōu)化的培養(yǎng)基中，考察不同（NH4）2SO4含量對產(chǎn)酶的影響。

1.2.4.9 無機鹽對產(chǎn)酶影響的正交實驗 經(jīng)過單因素優(yōu)化實驗，選擇MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCO34個因素，進(jìn)行L9（43）正交實驗，考察不同濃度鹽離子對產(chǎn)酶的影響。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The level of four tested factors on salts

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類誘導(dǎo)劑對產(chǎn)酶的影響

多數(shù)脂肪酶為誘導(dǎo)型酶，因此誘導(dǎo)劑的添加可顯著的增加脂肪酶的產(chǎn)量。研究表明在脂肪酶發(fā)酵過程中添加一定量的脂肪酸或脂類物質(zhì)不僅可以充當(dāng)碳源，提高菌體生物量，而且還可以起到誘導(dǎo)產(chǎn)酶的作用[7，14-15]。常用的脂肪酶誘導(dǎo)劑主要有：甘油三酯、長鏈脂肪酸、游離脂肪酸及其結(jié)構(gòu)類似物[16-17]等。本實驗考察了油酸、大豆油、花生油、橄欖油為誘導(dǎo)劑時對產(chǎn)酶的影響，實驗結(jié)果見圖1?；ㄉ?、橄欖油、大豆油實驗組在發(fā)酵63h時脂肪酶酶活達(dá)到最高值，而油酸實驗組達(dá)到最高值的發(fā)酵時間為65h，較三種天然油脂延長了2h。比較各組脂肪酶酶活，其最高值相差不大，油酸實驗組最高為77.5U/mL，大豆油最低為62.5U/mL，而花生油和橄欖油基本接近油酸實驗組，分別為75U/mL和72.5U/mL，因此油酸、花生油和橄欖油在發(fā)酵中均可充當(dāng)誘導(dǎo)劑和部分碳源，考慮到花生油成本較低，選擇花生油為最佳脂肪酶誘導(dǎo)劑。

圖1 不同種類誘導(dǎo)劑對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of inducer sources on lipase production

2.2 不同花生油含量對產(chǎn)酶的影響

圖2 不同花生油含量對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of concentrations of peanut oil on lipase production

如圖2所示，隨著花生油添加量的增加，脂肪酶酶活呈先升后降趨勢?；ㄉ蜐舛葹?.5mL/L的實驗組，由于含量較低，并不能滿足菌體生長需要，因此脂肪酶酶活較低，僅為60U/mL；當(dāng)花生油濃度高于10mL/L后，由于花生油添加量過大，碳氮比不均衡，花生油并不能被菌體完全利用，發(fā)酵結(jié)束后，在發(fā)酵液表面會殘留大量的團(tuán)塊狀脂類物質(zhì)，代謝不完全的產(chǎn)物一定程度上抑制了酶活，導(dǎo)致酶活較低；花生油濃度為5mL/L時，菌球分散均勻，形態(tài)飽滿，且酶活最高，因此選擇其為最佳花生油濃度。此結(jié)果與相關(guān)報道中油脂在低濃度時對產(chǎn)酶有利，高濃度時對產(chǎn)酶有一定抑制作用[18]的結(jié)論一致。

2.3 不同種類碳源對產(chǎn)酶的影響

圖3 不同種類碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of carbon sources on lipase production

由圖3可知，加入葡萄糖、乳糖、玉米淀粉和糊精的實驗組酶活低于對照組，分析原因，可能是由于5g/L的葡萄糖、乳糖對產(chǎn)酶有阻遏作用，這與多數(shù)研究得出的易利用碳源對產(chǎn)酶有抑制作用的結(jié)論相一致[19-20]。而玉米淀粉和糊精實驗組酶活較低的原因則是由于固定化菌體形態(tài)較差引起的。麩皮多糖實驗組脂肪酶酶活最高，達(dá)到80U/mL，且菌球形態(tài)較好，利于發(fā)酵液的傳質(zhì)。因此，選擇麩皮多糖為最優(yōu)碳源，并進(jìn)一步考察其濃度對產(chǎn)酶的影響。

2.4 不同麩皮多糖水解液含量對產(chǎn)酶的影響

圖4 不同麩皮多糖水解液含量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of concentrations of bran polysaccharide hydrolyzate on lipase production

隨著麩皮多糖水解液添加量的增加，脂肪酶酶活也呈上升趨勢，但當(dāng)麩皮多糖水解液大于75mL/L時，酶活出現(xiàn)下降。由此可知，添加適量的麩皮多糖水解液，起到了增加慢效碳源濃度的作用，有利于脂肪酶產(chǎn)生。但當(dāng)添加量過高時，菌體過度生長，酶活降低。添加量為75mL/L的實驗組酶活最高，脂肪酶酶活可達(dá)到85U/mL，因此選擇75mL/L為麩皮多糖水解液最適添加量。

2.5 不同種類有機氮源對產(chǎn)酶的影響

圖5 不同種類有機氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of organic nitrogen sources on lipase production

氮源是培養(yǎng)基的必備成分，培養(yǎng)基中氮源的種類、含量及其配比直接影響菌體生長的速度、菌體的形態(tài)控制，以及脂肪酶的產(chǎn)量。如圖5所示，在各實驗組中，豆粕粉、大豆蛋白、豆餅粉實驗組脂肪酶酶活較低，但原因卻不相同。前兩組是由于菌體過度生長，降低了固定化菌體的使用效果，脂肪酶產(chǎn)量低；而豆餅粉實驗組則是由于其含氮量較低，菌體生長緩慢，從而影響了脂肪酶的生成；全脂豆粉實驗組脂肪酶活力較高，但菌體過度生長，形態(tài)較差；小麥胚芽蛋白和棉籽蛋白實驗組，菌球呈飽滿的小球狀，分散均勻，發(fā)酵狀態(tài)良好，酶活較高，發(fā)酵64h，脂肪酶酶活分別達(dá)到72.5、90U/mL，其中棉籽蛋白實驗組中含有較多的不溶性含氮物質(zhì)，可作為慢效氮源，緩慢釋放，既保證了氮源的充足，又有效的控制了固定化菌體形態(tài)，因此選用棉籽蛋白作為最優(yōu)的有機氮源。

2.6 不同棉籽蛋白含量對產(chǎn)酶的影響

通過實驗發(fā)現(xiàn)棉籽蛋白含量10、15g/L的實驗組菌體的生長狀態(tài)良好，20、25g/L的實驗組菌體形態(tài)略成團(tuán)狀，固定化菌體效果較差；其中加入15g/L棉籽蛋白的實驗組酶活最高，達(dá)到90U/mL，此濃度可完全滿足菌體生長和產(chǎn)酶需求，所以選用添加量為15g/L的棉籽蛋白作為最適添加量。

圖6 不同棉籽蛋白含量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of concentrations of cottonseed protein on lipase production

2.7 不同種類無機氮源對產(chǎn)酶的影響

在脂肪酶發(fā)酵的研究中，一般認(rèn)為復(fù)合氮源對微生物生長及產(chǎn)酶有利[21-22]，有機氮源和無機氮源相復(fù)合其效果好于有機氮源的復(fù)合[23]。分別考察了復(fù)合不同無機氮源 （NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2HPO4、NH4NO3后對產(chǎn)酶的影響。實驗發(fā)現(xiàn)添加（NH4）2SO4和（NH4）2HPO4的實驗組酶活較高，分別為92.5、95U/mL，但由于（NH4）2HPO4實驗組中菌球呈絮狀生長，無法形成分散均勻的自聚集菌球，因此選擇（NH4）2SO4作為最佳無機氮源。

圖7 不同無機氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of inorganic nitrogen sources on lipase production

2.8 不同（NH4）2SO4濃度對產(chǎn)酶的影響

如圖8所示，通過對不同（NH4）2SO4添加量的實驗發(fā)現(xiàn)，加入（NH4）2SO4濃度為2g/L時脂肪酶酶活最高，達(dá)到95U/mL。所以選用2g/L為（NH4）2SO4的最優(yōu)濃度。

圖8 不同（NH4）2SO4濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of concentrations of（NH4）2SO4on lipase production

2.9 無機鹽對產(chǎn)酶的影響

研究表明無機鹽對發(fā)酵產(chǎn)酶也有顯著影響。通常認(rèn)為K+、Mg2+、Ca2+等對脂肪酶產(chǎn)生有促進(jìn)作用，而Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Co2+、Cu2+等則抑制脂肪酶產(chǎn)生[22]，因此選擇MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCO3考察不同濃度鹽離子對少根根霉產(chǎn)脂肪酶的影響。

表2 正交實驗結(jié)果分析Table 2 The analysis of the orthogonal experimental results on salts

正交實驗結(jié)果如表2所示，通過正交實驗發(fā)現(xiàn)4種無機鹽對產(chǎn)酶的影響大小順序為：A＞C＞B＞D，即MgSO4＞K2HPO4＞KH2PO4＞CaCO3。選擇均方最小的D作為誤差，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。因素A、C均具有顯著性影響，因此確定MgSO4和K2HPO4最優(yōu)添加量分別為A1、C2，即MgSO41g/L、K2HPO42.5g/L。KH2PO4及CaCO3不具顯著性，因此選擇不添加。確定少根根霉產(chǎn)脂肪酶的無機鹽最優(yōu)配方為：MgSO41g/L、K2HPO42.5g/L。

表3 方差分析表Table 3

2.10 最優(yōu)培養(yǎng)基驗證實驗

通過上述實驗獲得少根根霉產(chǎn)脂肪酶最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：花生油5mL/L、麩皮多糖水解液75mL/L、棉籽蛋白15g/L、（NH4）2SO42g/L、MgSO41g/L、K2HPO42.5g/L。對此配方進(jìn)行搖瓶驗證實驗，發(fā)酵64h，脂肪酶活達(dá)到最高，其值為100U/mL，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方對照組的1.33倍。

3 結(jié)論

在研究中發(fā)現(xiàn)作為誘導(dǎo)劑的花生油在低濃度時對產(chǎn)酶有利，高濃度時對產(chǎn)酶則有一定抑制作用；葡萄糖、乳糖等較易利用碳源對脂肪酶的生成有阻遏作用；棉籽蛋白和（NH4）2SO4組成的復(fù)合氮源較單一有機氮源對產(chǎn)酶有利；Mg2+、K+對產(chǎn)酶有顯著性影響，而Ca2+對產(chǎn)酶無顯著性影響。

通過單因子和正交實驗獲得了無載體固定化少根根霉產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：花生油5mL/L、麩皮多糖水解液75mL/L、棉籽蛋白15g/L、（NH4）2SO42g/L、MgSO41g/L、K2HPO42.5g/L。對所得最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶驗證實驗，在此條件下，少根根霉脂肪酶酶活可達(dá)100U/mL，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方對照組的1.33倍。

研究結(jié)果為無載體固定化少根根霉發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶奠定了實驗基礎(chǔ)，對進(jìn)一步規(guī)模化培養(yǎng)，實現(xiàn)根霉脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實意義。

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