李 煥，李美萍，張生萬

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006)

脂肪酸作為人體的必需營養(yǎng)素之一，在整個生命過程中起著至關(guān)重要的作用。隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，因此，業(yè)內(nèi)專家和科研人員對膳食脂肪酸的研究也越來越多。目前，脂肪酸的檢測方法最常用的是氣相色譜［1－3］和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用［4－5］。采用氣相色譜檢測，需要標(biāo)準(zhǔn)品對樣品進(jìn)行定性;采用氣質(zhì)聯(lián)用分析時，需要人工檢索解析，操作麻煩耗時，且費(fèi)用較高。而定量結(jié)構(gòu)－色譜保留相關(guān) (QuantitativeStructure－Retention Relationships，QSRR)的研究主要是建立化合物分子結(jié)構(gòu)參數(shù)和色譜保留值之間的定量關(guān)系，對選擇分離條件、預(yù)測保留時間和探索色譜保留機(jī)理有著重要的意義。建立有效的脂肪酸甲酯化合物QSRR模型可以節(jié)省大量的人力財力，同時對脂肪酸的分析工作具有一定的指導(dǎo)意義。由于油脂中脂肪酸組成復(fù)雜，且結(jié)構(gòu)相似，對分離柱的要求就相對較高。目前，應(yīng)用較為廣泛的是涂漬極性固定相的色譜柱，如聚乙二醇或氰丙基聚硅氧烷固定相。尤其是對組分較多的脂肪酸甲酯混合樣品的分離，一般選用柱長較長的脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，如OmegawaxTM柱(聚乙二醇)和SP－2560(強(qiáng)極性氰丙基聚硅氧烷)等，此類柱子價格昂貴，且應(yīng)用范圍較窄。本文以37種脂肪酸甲酯混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，選用30m長的Rtx－wax石英毛細(xì)管色譜柱作為分離柱，采用氣相色譜－氫火焰離子化檢測器(GC－FID)對其色譜分離條件進(jìn)行選擇，最終確定了一種分離效果較好的色譜條件。在該分離條件下，選用同一根色譜柱，通過氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC－MS)對37種脂肪酸甲酯做定性分析，確定了37種脂肪酸甲酯在Rtxwax色譜柱上的出峰順序。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Steric and Electronic Descriptors(SEDs)表征脂肪酸甲酯的三維分子結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用SPSS(version 16.0)軟件進(jìn)行逐步回歸分析，得到預(yù)測脂肪酸甲酯色譜保留時間的定量結(jié)構(gòu)－色譜保留相關(guān)(QSRR)模型，同時采用留一法(Leave－One－Out，LOO)交互檢驗(yàn)(Cross－Validation，CV)和外部驗(yàn)證的方法對所建模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力進(jìn)行分析和驗(yàn)證，均取得了較好的結(jié)果。本工作希望可以為脂肪酸的分析鑒定工作提供一條新途徑。

表1 SEDs參數(shù)名稱及其簡寫Table 1 SEDs parameter names and their abbreviations

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37種脂肪酸甲酯混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;正己烷 純度≥95.0%，色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

GC/MS聯(lián)用儀 型號7890A/5975C，附FID檢測器，美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸甲酯混標(biāo)溶液的制備 將25mg的37種脂肪酸甲酯混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶于2.00mL正己烷溶劑，在樣品瓶中密封，冷藏待用。

1.2.2 GC/MS測定條件 色譜條件:色譜柱:Rtxwax石英毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm×0.5μm);進(jìn)樣口溫度:250℃;柱流量:0.60mL/min;升溫程序:50℃保持2min，以5℃/min升到140℃，保持10min，再以1℃/min升到160℃，保持10min，再以1℃/min升到180℃，保持10min，再以1℃/min升到200℃，保持10min，再以1℃/min升到220℃，保持10min，然后以 2℃/min升到 230℃，保持 30min;檢測器(FID)溫度:250℃;檢測器氣體:氫氣 40mL/min，空氣450mL/min，尾吹氦氣30mL/min;進(jìn)樣量:0.2μL;分流比:10∶1。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源;離子源溫度230℃;電子能量70eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 15～500;接口溫度為280℃，四極桿溫度為150℃。

1.3 SEDs參數(shù)計算方法

本文采用 StericandElectronicDescriptors(SEDs)參數(shù)來表征脂肪酸甲酯的分子結(jié)構(gòu)信息，該參數(shù)能夠全面反映三維分子結(jié)構(gòu)的大小、形狀、對稱性、拓?fù)涮匦约半姾汕闆r等，具體的SEDs參數(shù)見表1［6－7］。SEDs 參數(shù)由能量最小的分子計算獲得，先利用ChemDraw Ultra(version 8.0)軟件勾畫脂肪酸甲酯的分子骨架，然后在Chem3D Ultra(version 8.0)軟件中，采用MM2方法和MOPAC軟件包進(jìn)行分子最小能量優(yōu)化，最后計算出37種脂肪酸甲酯的 SEDs參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜分離條件的選擇

由于待分離的37種脂肪酸甲酯存在多種異構(gòu)體，在選擇色譜柱時，應(yīng)綜合考慮脂肪酸甲酯的碳原子數(shù)、不飽和度以及雙鍵的位置等多個因素。對于同分異構(gòu)體及碳數(shù)相同、雙鍵個數(shù)不同的物質(zhì)，在非極性柱上很難分開;另外考慮到脂肪酸甲酯分析專用柱多為極性固定相，因此，本實(shí)驗(yàn)選用強(qiáng)極性的Rtx－wax(聚乙二醇)色譜柱分離37種脂肪酸甲酯。又由于待分離的37種物質(zhì)，沸程較寬，且有些化合物的沸點(diǎn)比較接近，故采取多步程序升溫的方法，且升溫速率盡量小，以便沸點(diǎn)接近的化合物能夠很好的分離;同時對載氣流速進(jìn)行考察，最終確定的同時分離37種脂肪酸甲酯的色譜條件如1.2.2節(jié)中所述，在此條件下，達(dá)到了較好的分離效果，且峰形較好。得到的37種脂肪酸甲酯的氣相色譜圖見圖1。

2.2 SEDs參數(shù)與脂肪酸甲酯氣相色譜保留時間的相關(guān)性研究

2.2.1 模型建立 本文中用于建模的37個脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間均來自于筆者實(shí)驗(yàn)所得。

首先計算出37個樣本的SEDs參數(shù)，借助多元線性回歸(MLR)方法對37個脂肪酸甲酯的SEDs參數(shù)和tR(exp)進(jìn)行相關(guān)性研究，采用SPSS(version 16.0)軟件進(jìn)行逐步回歸分析，篩選出最優(yōu)變量。建立定量結(jié)構(gòu)－保留關(guān)系(QSRR)模型，采用留一法(LOO)交互檢驗(yàn)(CV)對所建模型進(jìn)行驗(yàn)證，觀察模型相關(guān)系數(shù)(R)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、留一法(Leave－One－Out，LOO)交互檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)(RCV)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SDCV)隨引入變量數(shù)的增加而變化的情況。為控制模型穩(wěn)定性和消除變量間共線性的影響，對每步變量進(jìn)行方差膨脹因子(VIF)［8］計算。VIF=(1－R2)－1，式中 R為某自變量與其它變量相關(guān)程度(經(jīng)自由度校正)。VIF值為1.0，表示各變量間無相關(guān)性;VIF值在1.0～10.0之間，表示變量間無明顯共線性，相關(guān)方程可接受。逐步回歸分析及變量膨脹因子(VIF)計算結(jié)果見表2。

圖1 37種脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of 37 fatty acid methyl esters

從表2中可以看出，逐步回歸分析中，當(dāng)選用變量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW 建模時，相關(guān)系數(shù)R最大，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD最小;且留一法交互檢驗(yàn)過程中，同樣是選入變量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW建模時，RCV值最大，SDCV值最小。而為了保證模型穩(wěn)定性及消除變量共線性，要求模型中各變量VIF不大于10，滿足這一條件的有模型2和模型6，其中模型2中的R、SD、RCV和SDCV均較大，綜合分析，最終以模型6為最佳模型。所見QSRR模型如M1:

交互檢驗(yàn):RCV=0.9951，SDCV=4.9251，F(xiàn)CV=789.1953

其中，N為回歸樣本數(shù)，m為變量個數(shù)，R為相關(guān)系數(shù)，SD 為標(biāo)準(zhǔn)誤差，F(xiàn)為 Fisher檢驗(yàn)值，RCV、SDCV、FCV分別為留一法交互檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤差和Fisher檢驗(yàn)值。

模型M1的相關(guān)系數(shù)R=0.9990，留一法(LOO)交互檢驗(yàn)(CV)的相關(guān)系數(shù)RCV=0.9951，與建模時的相關(guān)系數(shù)R很接近，二者均接近1，說明所建模型的穩(wěn)定性較好［9］。建模時引入的變量參數(shù)及保留時間見表3。另外使用模型M1對37種脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間進(jìn)行預(yù)測，并將預(yù)測值對實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)情況及殘差分布散點(diǎn)圖分別繪于圖2、圖3中。

圖2 MLR模型預(yù)測值、留一法交互檢驗(yàn)預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)性Fig.2 Plot of estimated values，observed ones of Leave－One－Out，LOO and observed ones

圖3 MLR模型預(yù)測值、留一法交互檢驗(yàn)預(yù)測值的誤差分布Fig.3 Plot of Err EST vs.N

從圖2中可以看出，模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值符合的較好，留一法交互檢驗(yàn)的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的線性相關(guān)性較好，具體表現(xiàn)為圖2中樣本均勻分布在過原點(diǎn)的45°直線周圍。圖3顯示，模型預(yù)測值誤差大多數(shù)點(diǎn)均勻分布在±2SD之間，留一法交互檢驗(yàn)預(yù)測值誤差基本上均勻分布在±2SDCV之間。

表2 逐步回歸及變量膨脹因子值Table 2 The results of stepwise regression and VIF

表3 模型中引入的變量及37種脂肪酸甲酯保留時間(tR)的實(shí)驗(yàn)值、預(yù)測值Table 3 The introduced variables and observed values and predicted ones of 32 kinds of fatty acid methyl esters

2.2.2 模型驗(yàn)證 在定量構(gòu)效關(guān)系的研究中，對所建模型的外部預(yù)測能力和真實(shí)有效性進(jìn)行驗(yàn)證是非常重要的一部分。目前廣泛使用的一種模型驗(yàn)證方法是留一法(LOO)交互檢驗(yàn)(CV)。然而Tropsha等人［10］的研究結(jié)果表明:模型的外部預(yù)測能力與RCV值的大小并沒有明顯的相關(guān)性，而是采用外部樣本(即測試集)預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)Q2ext來衡量:

式中:yi為測試集中樣本的實(shí)驗(yàn)值;ˉyi為測試集樣本的預(yù)測值;ˉytr為訓(xùn)練集樣本實(shí)驗(yàn)值的平均值。

為了驗(yàn)證模型對外部樣本的預(yù)測能力，將上述37個樣本分為兩組，按照大約三分之一的樣本作為測試集，大約三分之二作為訓(xùn)練集，從第一號樣本開始，每隔2個取一個樣本作為測試集，這樣得到25個樣本作為訓(xùn)練集(Training Set)，12個樣本作為測試集(Test Set)。測試集樣本在表3中用“*”號標(biāo)出。對訓(xùn)練集中的25個樣本建模，采用逐步回歸進(jìn)行變量篩選，結(jié)合變量的方差膨脹因子VIF值，篩選出四個最優(yōu)變量(TVcon、SVDe、Windex、Bindex)，借助多元線性回歸建立如下QSRR模型(M2):

交 互 檢 驗(yàn):RCV=0.9943，SDCV=5.5598，F(xiàn)CV=433.1412

采用上述12個外部樣本(測試集)對所建模型的外部預(yù)測能力進(jìn)行檢驗(yàn)，利用公式(1)計算得到=0.9995，進(jìn)一步表明模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。

2.2.3 模型分析 脂肪酸甲酯的定量結(jié)構(gòu)－色譜保留相關(guān)模型如M1所示。該模型中引進(jìn)的四個變量分別為 Windex、Bindex、SVDe、TVcon。由此可知該類型脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間與 Windex、Bindex、SVDe、TVcon 有關(guān)。

Windex指數(shù)是分子骨架中各碳原子間距離總和，其值隨分子的增大而增加，隨分子的支化程度增加而減小。Windex值的大小反映了溶質(zhì)分子與固定相作用時色散力強(qiáng)弱的信息。Windex值越大，溶質(zhì)與固定相之間的色散力越大，保留時間越長，即Windex與脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間呈正相關(guān)。

Bindex指數(shù)是建立在分子圖的距離矩陣基礎(chǔ)上而構(gòu)造產(chǎn)生的，對不飽和鍵給予區(qū)分，反映了分子的大小和形狀等結(jié)構(gòu)信息［11］。從表3中可見，隨著碳數(shù)的增多保留時間基本呈上升趨勢，其原因是溶質(zhì)分子碳原子數(shù)越多，與固定相接觸面積越大，色散力越大;當(dāng)碳鏈相同時，Bindex值是相同的，但保留時間卻隨著飽和度的增大而增大。其原因可能是在不飽和程度增大的過程中，雖然極化力和誘導(dǎo)力是增大的，但因C=C相對于C－C來說，鍵長縮短，導(dǎo)致色散力減小。綜合多種因素的共同影響，模型中Bindex系數(shù)為負(fù)值是可以理解的。

SVDe為溶質(zhì)分子中所有原子點(diǎn)價之和［12］，包含了溶質(zhì)分子與固定相作用時色散力和誘導(dǎo)力的信息，溶質(zhì)分子色譜保留時間隨其SVDe值的增大而增大，這與模型中SVDe的系數(shù)為正值是一致的。

TVCon 反映分子的電子結(jié)構(gòu)信息［13－15］。TVCon值越小，表明分子不飽和度越大，誘導(dǎo)力和取向力隨之增大，溶質(zhì)分子的色譜保留時間也就越長。模型中，TVCon系數(shù)最小，表明TVCon對脂肪酸甲酯的色譜保留時間貢獻(xiàn)較小，并不是主要的影響因素。

在所建模型M1中，Windex系數(shù)最大，說明該極性固定相上，分子體積對脂肪酸甲酯化合物色譜保留時間的影響起主要貢獻(xiàn)。1、2、3號化合物由于結(jié)構(gòu)簡單，分子體積小，在極性固定相上的誤差較大是正常的。

3 結(jié)論

對于37種脂肪酸甲酯的分離，通常使用脂肪酸甲酯分析專業(yè)色譜柱，這類色譜柱價格昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室不易實(shí)現(xiàn)。本工作選用30m長的Rtx－wax石英毛細(xì)管色譜柱，就能對37種脂肪酸甲酯取得較好的分離效果。Rtx－wax在一定程度上可以取代脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，避免使用價格昂貴脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)際應(yīng)用性較強(qiáng)。QSRR研究結(jié)果表明，SEDs參數(shù)可以較好地表征脂肪酸甲酯類化合物的分子結(jié)構(gòu)特征，采用SEDs建立的QSRR模型具有較好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力，可以較好地預(yù)測該類化合物的氣相色譜保留時間，該方法為植物油脂中脂肪酸的分析工作提供了一定的理論依據(jù)。

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