周亞迪，李誠，葉瑞雪

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安 625014）

熱變性法提取鴨血SOD的響應面優(yōu)化

周亞迪，李誠*，葉瑞雪

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安 625014）

摘 要：以新鮮鴨血為原料，研究鴨血超氧化物歧化酶（SOD）在熱變性環(huán)境下的提取工藝。通過單因素試驗確定了熱變性溫度、熱變性時間、硫酸鋅濃度3個因素的取值范圍，并根據(jù)中心組合設計原理及響應面分析得出最優(yōu)提取條件。結果表明：熱變性溫度55.3℃，熱變性時間12 min，硫酸鋅的質量濃度3.9%，硫酸銅的質量濃度1%，SOD比活為1 224.37 U/mg。

關鍵詞：鴨血；超氧化物歧化酶；熱變性；響應面法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是人體內清除超氧陰離子自由基的有效物質，因其具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等保健效果，現(xiàn)已廣泛運用到生物化學、酶學、生物學、分子生物學和醫(yī)學等諸多學科[1-3]。國內外有不少單位將SOD作為天然抗氧化劑加到面包、糕點、方便面及罐頭食品中，作為防腐劑收到了很好的效果。并有實驗證明，SOD能夠口服吸收，并能在體內保持良好的活性，因此SOD在食品行業(yè)的運用具有良好的開發(fā)前景。

SOD的主要來源是動物血和肝臟，動物血中SOD不僅含量豐富，且提取方便成本低，紅細胞膜易破[4]，我國每年來自畜禽的血源有2 300萬t，而很久以來我國對血液有足夠的認識，但沒有充分的利用[5]。一方面給予血液很高的評價，認為血液具有較高的營養(yǎng)保健作用，是一種很好的蛋白質資源[6]。而另一方面，由于受諸多因素的限制，目前利用率不到1%[7]，致使大量寶貴的畜禽血液資源浪費，并造成環(huán)境污染。目前對豬血、羊血、牛血等畜血中SOD有部分研究[8-10]，提取工藝也相對較成熟，而對于禽血研究相對較少。2009年我國鴨的存欄量、出欄量均居世界首位[11]。因此，充分利用鴨血生產SOD大有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前提取SOD的主要方法有鹽析法、溶脹法、有機溶劑法、酶法等，工藝較復雜，所用溶劑易污染環(huán)境，且成本較高。而熱變性法是利用血細胞中SOD和血紅蛋白的變性溫度不同來分離除去雜蛋白，達到提取出SOD的目的。該方法操作簡便，成本低廉，環(huán)保，但是同樣存在很多不足[12-13]。有研究表明，在熱變性法提取SOD工藝中，硫酸鹽比氯鹽對SOD的保護效應好，銅鋅鹽互配比單一的銅鹽或鋅鹽對SOD的保護效應好[14]。本實驗以熱變性法為基礎，重點研究SOD在提取過程中各影響因素（銅鋅鹽互配濃度、熱變性溫度、熱變性時間）對SOD活性的影響，并利用響應面分析的方法來求出最佳工藝條件，為制備高活性的SOD提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨血采自四川省雅安市創(chuàng)業(yè)商城市場；檸檬酸三鈉、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸銅等均為分析純，考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白。

1.2 儀器與設備

BR4i型多功能冷凍離心機：美國THERMO公司；Mill-Q型超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；Scientz-ⅡD型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV-3200掃描型紫外可見分光光度計、V-1200型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；BT 12S電子天平、pHS-3C精密pH計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶血液的制備

新鮮鴨血以3.8%檸檬酸三鈉抗凝，4℃條件下5 000 r/min離心15 min除去黃色血漿，收集紅血球，4℃條件下用生理鹽水洗滌紅血球，5 000 r/min離心10 min，洗滌3次，量取血球體積，加入等體積超純水得到溶血液，0℃～4℃條件下用超聲波細胞粉碎儀破碎血細胞（200 W/10 min），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 熱變性提取工藝單因素實驗

以新鮮鴨血為原料，考察提取SOD的工藝參數(shù)，重點考察熱變性溫度，熱變性時間，硫酸鹽濃度對SOD活性的影響。

1.3.3 提取工藝條件的響應面分析

在單因素試驗基礎上，確定Box-Behnken設計的自變量，以SOD比活力為響應值，利用Design-Expert7.1.6軟件進行響應曲面分析優(yōu)化提取條件。

1.3.4 SOD活性的測定

鄰苯三酚自氧化速率測定法[15]。

1.3.5 樣品中蛋白質含量的測定

考馬斯亮藍比色法[16]。

2 結果與分析

2.1 蛋白質標準曲線的建立

標準曲線的繪制：用蛋白質標準液配成不同濃度的蛋白質溶液，在595 nm波長下比色測定光吸收值，以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制出標準曲線為y=0.005 1x+0.0013，R2=0.996 8。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 熱變性溫度對酶活性的影響

選取 45、50、55、60、65 ℃ 5 個溫度考察熱變性溫度對酶活性的影響，結果見圖1。

圖1 熱變性溫度對酶活性的影響Fig.1 The effect of heating denaturation temperature on activity of SOD

由圖1可知，鴨血中SOD的酶比活在熱變性溫度45℃～60℃呈緩慢上升趨勢，65℃時較60℃時的酶比活稍低，65℃～70℃時的酶比活完全呈急劇下降趨勢，說明高于65℃的熱變性溫度對SOD的活性有直接負面的影響，因此最佳熱變性溫度范圍選擇為55℃～65℃，最佳熱變性溫度是60℃。

2.2.2 熱變性時間對酶活性的影響

選取 10、15、20、25、30 min 5 個時間考察熱變性時間對酶活性的影響，結果見圖2。

圖2 熱變性時間對酶活性的影響Fig.2 The effect of heating denaturation time on activity of SOD

由圖2可知，隨著加熱時間的延長，SOD活性處于上升趨勢，熱變性時間在15 min時，鴨血中SOD的活性達到最高，之后呈下降趨勢，在熱變性溫度在20 min以后，酶活性趨于穩(wěn)定，說明熱變性時間在20 min以后，對SOD活性的影響較小，因此熱變性的最佳時間范圍是10 min～20 min，最佳熱變性時間是15 min。

2.2.3 硫酸鋅濃度對酶活性的影響

在前期的預實驗中，發(fā)現(xiàn)硫酸銅濃度一定時，硫酸鋅的質量濃度在1%時，鴨血中SOD的酶比活達到最高值，隨著硫酸鋅的濃度逐漸升高，SOD的活性反而降低，說明低濃度的硫酸鋅對SOD具有保護作用。因此，本實驗選擇在質量濃度為1%硫酸鋅濃度下，硫酸銅濃度在1%～8%變化范圍內對酶活性的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同硫酸鋅質量濃度對酶活性的影響Fig.3 The effect of concentration of zinc sulfate quality on activity of SOD

由圖3可知，硫酸鋅濃度在1%時，隨著硫酸銅的質量濃度逐漸增加，鴨血中SOD的活性在逐漸升高，在4%時達到最大值，隨后急劇下降，SOD的活性在硫酸銅濃度在5%～8%的范圍時趨于平穩(wěn)狀態(tài)，說明，硫酸銅的濃度增加到5%后對SOD的活性影響減小，因此最佳提取鴨血中SOD硫酸銅濃度為4%。

2.3 提取工藝條件的響應面優(yōu)化分析

2.3.1 響應面法試驗設計及結果

綜合單因素試驗結果，根據(jù)中心組合試驗設計原理，以熱變性溫度，熱變性時間，硫酸銅濃度為自變量，分別由A、B、C表示，以酶比活為響應值，進行試驗設計，利用Design-Expert7.1.6數(shù)據(jù)分析軟件優(yōu)化提取條件。試驗因素水平編碼見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2.3.2 回歸模型建立及方差分析

回歸模型建立及方差分析見表3。

經(jīng)Design-expert7.6軟件對試驗結果進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到以酶比活為目標函數(shù)的回歸方程：

表2 響應面優(yōu)化試驗Box-Benhnken設計及結果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

從表3可以看出，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，模型的顯著水平遠遠小于0.05，因此酶比活回歸方程（模型）的回歸效果極顯著，其中，C、A2、B2、C2對結果影響顯著。此時從回歸方程各項的方差分析結果（回歸系數(shù)R2=0.924 7＞0.9）還可以看出方程的失擬項較小，說明該回歸方程對實際實驗擬合情況較好，各自變量和響應值之間線性關系顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對SOD活性影響的大小依次為熱變性時間＞硫酸鋅濃度＞熱變性溫度。

圖4 各因素交互作用等高線和響應面圖Fig.4 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

2.3.3 響應面曲面分析

在本實驗中，每一個響應面對其中兩個因素進行分析，另外一個因素被固定在零水平[17]，利用Design-Expert7.1.6軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合[18]，各因素之間的交互作用見圖4。

圖4直觀地反映了各因素對酶活性的影響。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，圓形表示兩交互作用不顯著，橢圓形表示兩交互作用顯著[19]，從三維響應面圖可以看出每個響應面都具有各自的較優(yōu)區(qū)域[20]。比較圖4中的等高線圖，各等高線都呈現(xiàn)橢圓狀態(tài)，且硫酸鋅濃度與熱變性溫度的交互作用相對較顯著。各響應面圖中，熱變性時間對酶活性的影響較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。

由Design-Expert7.1.6軟件分析得到的最大響應值時對應的編碼值分別為A=-0.108，B=0.057，C=-0.397，與之相應的熱變法提取鴨血SOD工藝最佳條件為硫酸鋅濃度3.89%、熱變性溫度55.28℃、熱變性時間11.98 min，理論最佳提取條件下的酶比活為1 243.25 U/mg。

2.3.4 驗證試驗

為了驗證此方法的可靠性，采用所得到的最佳提取工藝條件進行驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為硫酸鋅濃度3.9%，硫酸銅濃度1%、熱變性溫度55.3℃、熱變性時間12 min條件下，驗證試驗結果，重復試驗3次，結果取平均值，酶比活為1 224.37 U/mg?？芍A測結果與實際情況擬合較好。

3 結論

本實驗在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析確定了熱變性法提取鴨血中SOD的最佳工藝條件，即硫酸鋅濃度3.9%，硫酸銅濃度1%、熱變性溫度55.3℃、熱變性時間12 min，SOD活性達1 224.37 U/mg。各因素對SOD活性影響的大小排序為：熱變性時間＞硫酸鋅濃度＞熱變性溫度。本實驗為鴨血中SOD的熱變性法提取工藝進行改進，與傳統(tǒng)提取工藝相比提高了SOD活性[21]，為進一步保持高活性分離純化鴨血SOD提供了科學參考。

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Optimizing Heating Denaturation Extraction of SOD from Duck Blood by Response Surface Methodology

ZHOU Ya-di，LI Cheng*，YE Rui-xue
（College of Food Science ，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China）

Abstract：With fresh duck blood as raw materials，study of superoxide dismutase （SOD） from duck blood in thermal denaturation conditions extraction process.hrough single factor experiment to determine the thermal denaturation temperature，heating time，the zinc sulfate concentration by a factor of three range，and according to a central composite design principle and response surface analysis the optimum extraction conditions.The results show that： the thermal denaturation temperature at 55.3 ℃， heating time 12 min，the concentration of 3.9%zinc sulfate，copper sulfate concentration of 1%，SOD specific activity of 1 224.37 U/mg.

Key words：duck blood；superoxide dismutase（SOD）；heating denaturation method；response surface method（RSM）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.005

2010年教育部國家級創(chuàng)新性實驗（101062625）

周亞迪（1990—），女（漢），在讀本科，研究方向：農產品貯藏及加工工程。

李誠（1964—），男，教授，碩士，研究方向：畜產品加工與質量安全控制。

2012-12-23