胥 冰 應小平 方 艷 吳肖曉 陜西中醫(yī)學院（西安 712046）

我們通過長期臨床觀察表明，中藥復方山仙顆粒（SXG）在抑制惡性腫瘤生長和轉移方面均有較好療效[1，2]。SXG以扶正固本、軟堅散結、活血化瘀之大法[1]治療惡性腫瘤，本研究旨在觀察大鼠SXG含藥血清對S-180肉瘤細胞bax、VEGF蛋白表達的影響，探討其治療腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑 山仙顆粒（SXG）陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑中心（生產日090328）一抗：Bax兔抗鼠多克隆抗體，二抗：生物素化羊抗兔IgG，VEGF鼠源單多隆抗體，熒光（FITC）標記羊抗兔IgG武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色劑 北京博奧森生物技術有限公司 。

1.2 主要儀器 超凈工作臺 蘇州凈化，倒置顯微鏡 奧特BDS-200，二氧化碳培養(yǎng)箱 德國BindCD-150，倒置熒光數碼顯微鏡 Nikon TS-100F（配 DS-5MC），研究級正置顯微鏡 Zeiss AxioImager A1（配Nikon DXM1200F），電子精密天平 塞多利斯，全自動高壓滅菌器 日本三洋MLS-3780。

1.3 實驗動物、瘤株 健康SD大鼠20只（雌、雄各半），6～8周齡，體質量（250±5）g，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（軍）2002-005；S-180肉瘤瘤株 第四軍醫(yī)大學。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備及滅活 大鼠分籠飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周隨機分為4組（n＝5）：空白組；對照組；含藥血清大劑量組；含藥血清小劑量組。含藥血清組，按中藥人、鼠劑量換算標準換算后，以大鼠2.5g／（kg·次）（相當于臨床等效劑量10倍），配制濃度為山仙顆粒（g）∶生理鹽水（mL）為1∶2，配成0.5g／mL懸液，即5mg／（kg·次）灌胃給藥，空白組，給予同劑量生理鹽水[4]。于上、下午各灌胃1次，連續(xù)7d，末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）2h后，3%戊巴比妥鈉0.15mL／100g腹腔注射麻醉，頸動脈采血，離心取上清液，經0.22μm濾器濾過除菌，同組混勻，經56℃，30min滅活后分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)及擴增 將S-180肉瘤細胞接種于含10%胎牛血清、100u／青霉素、100U／鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，取對數生長期細胞，制備成1×105／mL細胞懸液，接種于6孔板，每孔1800μl。分為4組，每組設3個復孔。于空白組：加入200μl小牛血清；含藥血清大劑量組 ：加入200μl100%含藥血清；含藥血清小劑量組：加入100%含藥血清20μl和小牛血清180μl，制成10%含藥血清；對照組：加入200μl100%正常大鼠血清。

2.3 免疫細胞化學檢測 S-180肉瘤細胞bax、VEGF的表達培養(yǎng)24、48、72h后，分別取出細胞離心洗滌，調整密度約為105個／mL制備細胞涂片，多聚甲醛固定。阻斷內源性過氧化物酶，抗原熱修復，按試劑盒說明操作S-P法免疫組化染色，光鏡下觀察，胞漿及核膜內出現黃色或棕黃色物質為Bax陽性細胞。胞質／胞核內出現黃褐色顆粒為VEGF陽性表達。隨機選取5個視野（×200）分別計數Bax、VEGF陽性細胞數，計數100個細胞，計算陽性細胞表達率。

2.4 免疫熒光化學檢測 S-180肉瘤細胞Bax、VEGF的表達分組培養(yǎng)24h，48h，72h后，同上法制備細胞涂片，固定阻斷內源性過氧化物酶抗原熱修復，5%BSA封閉液作用，按試劑盒說明操作，50%緩沖甘油封片避光，5min內快速在熒光顯微鏡下觀察細胞。

3 結 果

3.1 免疫細胞化學檢測S-180肉瘤細胞bax、VEGF的表達 bax定位于細胞漿及核膜，陽性表達呈黃褐色顆粒；VEGF定位于胞質／胞核，光鏡下觀察，由圖1、2及表1、2可知，含藥血清大、小劑量組在24h、48h、72h內S-180肉瘤細胞中bax、VEGF表達均有顯著性差異（P＜0.05），bax隨作用時間延長而增高；相反VEGF隨作用時間延長而降低。大、小劑量組與對照組比較及大、小劑量組間比較均有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 免疫細胞化學法檢測S-180肉瘤細胞bax的表達（×200）

圖2 免疫細胞化學法檢測S-180肉瘤細胞VEGF的表達（×200）

圖3 免疫熒光化學法檢測S-180肉瘤細胞bax的表達（×200）

圖4 免疫熒光化學法檢測S-180肉瘤細胞VEGF的表達（×200）

表1 各組不同時間段對S-180細胞bax表達的影響（）

表1 各組不同時間段對S-180細胞bax表達的影響（）

注：各組與相同時段對照組比較，△P＜0.05；相同組在不同時段比較，▲P＞0.05，◇P＜0.05

組 別 n 24h 48h 72h空白組 538.17±5.36▲ 35.68±4.52▲ 30.83±3.69▲含藥血清大劑量 556.15±2.08△◇52.06±3.12△◇54.21±1.98△◇含藥血清小劑量 547.36±3.32△◇44.52±5.43△◇41.87±2.96△◇對照組 536.52±4.21▲ 34.06±6.39▲ 31.25±7.29▲

表2 各組不同時間段對S-180細胞VEGF表達的影響（）

表2 各組不同時間段對S-180細胞VEGF表達的影響（）

注：各組與相同時段對照組比較，△P＜0.05；相同組在不同時段比較，▲P＞0.05，◇P＜0.05

組 別 n 24h 48h 72h空白組 566.25±4.38▲ 65.16±3.82▲ 63.34±6.85▲含藥血清大劑量 548.09±3.15△◇42.29±4.17△◇39.72±5.32△◇含藥血清小劑量 553.33±2.83△◇48.47±3.25△◇41.87±4.18△◇對照組 567.29±4.61▲ 63.54±3.05▲ 60.07±5.13▲

3.2 免疫熒光化學法檢測S-180肉瘤細胞bax、VEGF表達 bax表達于胞漿和核膜上，VEGF定位于胞質／胞核，熒光顯微鏡下觀察，由圖3、4知，呈明顯黃綠色鮮艷熒光，含藥血清大、小劑量組在 24h，48h，72h 時，S-180肉瘤細胞中 bax、VEGF表達，隨血清作用時間延長，bax熒光亮度增強，VEGF熒光亮度減弱；含藥血清大、小劑量組中bax熒光亮度明顯增強，VEGF熒光亮度明顯減弱，與對照組比較，有顯著性差異，大、小劑量組比較，肉瘤細胞中的bax、VEGF的表達有差異。

4 討 論 山仙顆粒（SXG）為中藥復方制劑，在抑制惡性腫瘤生長和轉移方面均有較好療效[3，4]。SXG以西洋參滋陰補氣，清熱生津；莪術能行氣破血，消積止痛；生山楂等助莪術行氣，消食化積，活血化瘀；龜板抑陰潛陽；仙鶴草補虛扶正，諸藥合用共奏扶正固本，軟堅散結，理氣化滯之功。顯示出較好的臨床效果，本實驗采用免疫組化法及免疫熒光化學法檢測S-180肉瘤細胞中bax、VEGF表達。bax為凋亡促進基因，bcl-2是凋亡抑制基因，其基因蛋白產物能抑制細胞凋亡，延長細胞生存周期；Bax基因的蛋白產物可與bcl-2形成異二聚體，使bcl-2的抗凋亡能力喪失而促進細胞凋亡。與正常組織相比，在腫瘤組織Bax往往低表達。本實驗發(fā)現S-180肉瘤細胞中Bax在不同劑量SXG含藥血清中表達升高，表明山仙顆粒含藥血清能上調bax蛋白表達。與應小平等報道山仙顆粒對小鼠S180肉瘤組織中Bax基因表達的影響結果相同[5]。

腫瘤生長依賴新生血管的形成已經是腫瘤生物學上研究比較透徹的一個方面。腫瘤生長依賴血液供應，需要生成新生血管，而血管內皮生長因子（VEGF）在新生血管生長過程中能強烈促使血管內皮有絲分裂并最終形成新生血管，為腫瘤的生長提供豐富的營養(yǎng)充足的血供。是刺激腫瘤血管生成最強的細胞因子[6]。VEGF過表達，通過促進腫瘤血管的生成而促進細胞的生長。不同劑量SXG含藥血清有效地抑制VEGF的表達，與崔劉福等報道結果一致[7]。

綜上所述，SXG含藥血清具有誘導腫瘤細胞凋亡，對大鼠S180肉瘤具有抑制作用。機制可能與其能明顯增強S-180肉瘤細胞中Bax基因的表達，降低VEGF的表達誘導肉瘤細胞的凋亡而實現的。但SXG成分復雜，是否通過其他途徑達到抗腫瘤效果。確切的抗癌作用機制尚不完全明確，有待于進一步研究。

[1]王希勝，陳光偉，李紅廷，等.山仙顆粒治療惡性腫瘤56例[J].陜西中醫(yī)，2002，23（9）：778.

[2]李光耀，辛春雷，張彬海，等.海生素對K562細胞生長及凋亡基因表達的影響[J].解剖學報，2008，39（5）：713.

[3]金泉克，肖海娟，孫 玨，等，中藥復方腸胃清含藥血清對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（5）：34-35.

[4]曹治云，杜 建.扶正抑瘤方對ICR小鼠H22皮下移植瘤組織中凋亡相關因子表達的影響[J].福建中醫(yī)藥大學學報 ，2012 ，22 （2）：27.

[5]應小平 ，史迎麗 ，郭蘭生，等.山仙顆粒對小鼠S180肉瘤組織中Bax基因表達的影響[J].現代腫瘤醫(yī)學，2007，15（9）：1240.

[6]段澤星，謝立群.VEGF在腫瘤生長和血管生成中的作用[J].世界華人消化雜志，2010，18（27）：2894-2896.

[7]崔劉福，姚樹坤，宋海澄，等.肝癥口服液含藥血清抑制肝癌細胞SMMC-7721血管內皮生長因子表達[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2004，10（5）：52.