黃玉劍 王秦勇 丁 瑾 衛(wèi)培峰 陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學院（渭南 714000）

何首烏始載于《開寶本草》，為蓼科蓼屬植物何首烏（Polygonummultiflorum Thunb）的塊根，經(jīng)過炮制后具有補益精血，固腎烏須之功，該藥歷來為古今醫(yī)家、飲食家所推崇，近幾年來許多補血類中成藥、保健食品中均將制首烏作為主要成分之一，應用較為廣泛。近幾年國內(nèi)外報道[1]的何首烏不良反應日漸增多，且主要集中在肝臟不良反應，因而何首烏安全性問題引起國內(nèi)外學者們的高度關(guān)注。相關(guān)文獻報道[2]，何首烏中大黃素可能為何首烏的毒性成分，而該成分與炮制方法關(guān)系密切，因此本文就何首烏生品及不同炮制品中大黃素進行測定，以探討分析不同何首烏炮制品致肝損傷的潛在風險。

1 實驗材料

1.1 儀器高效液相色譜儀（Lab Alliance型恒流泵；Waters966二極管陣列檢測器；活德國際貿(mào)易（上海）有限公司；Millennium 32色譜工作站）、C18色譜柱（Diamosil 4.6×250mm，5μm）、BP211D型分析天平（德國賽多利斯）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、FOEA26810D型純水機（Millipore公司）。

所用化學試劑為分析純（天津富宇化學試劑廠）、液相用試劑為色譜純（美國Fisher scintific）。

1.2 藥 材 實驗所需何首烏來自陜西省藥材市場，產(chǎn)自四川。經(jīng)鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根。按照2010版《中國藥典》和《本草綱目》的方法炮制何首烏。

2 實驗方法

2.1 何首烏水提物的制備 取何首烏生品及不同炮制品飲片各30g，煎煮提取，第1次加8倍量水，提取1h，傾出提取液，殘渣再加6倍量的水，提取1h，合并2次提取液，水浴蒸干，真空干燥，即得，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 何首烏水提物供試溶液的制備 取何首烏生品及不同炮制品水提物粉末0.2g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重（準確至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，稱重，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為測定游離型蒽醌的供試品溶液。

2.3 何首烏醇提物供試溶液的制備 取何首烏生品及不同炮制品細粉（過4號篩）0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重（準確至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，稱重，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為測定游離型蒽醌的供試品溶液。

2.4 對照品溶液的配制 分別精密稱取大黃素、大黃酚和大黃酸標準品適量，用甲醇分別配成質(zhì)量濃度為0.0605mg／mL的大黃素標準溶液、0.0644mg／mL的大黃酚標準溶液和0.0996mg／mL大黃酸標準溶液。

2.5 色譜分析條件 參照高效液相色譜法（附錄ⅥD）測定，色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Diamosil（4.6×250mm，5μm、NO：6004988）；以甲醇-0.1%磷酸（85：15）為流動相；流速：1.0mL／min；檢測波長：254nm；柱溫：室溫，進樣量：10μL。理論塔板數(shù)按大黃素峰計算不低于3000。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關(guān)系的考察：分別精密量取貯備液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL進樣，測定峰面積，以大黃素對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程得：y＝4E＋06x－15524（R2＝0.9997）。結(jié)果見表1。

表1 大黃素線性關(guān)系考察

結(jié)果表明：在0.121～0.726μg范圍內(nèi)，大黃素峰面積y與進樣量x（μg）線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗：精密吸取樣品溶液10μL，重復進樣6次，測定大黃素峰面積。結(jié)果見表2。

表2 精密度結(jié)果

結(jié)果表明：精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗：精密吸取何首烏生品供試品溶液10μL，重復進樣6次，測定大黃素峰面積。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果表明：供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復性試驗：按擬定的含量測定條件及方法，取同一批號樣品供試液，平行稱取6份進行含量測定。結(jié)果見表4。

表4 重復性結(jié)果

結(jié)果表明：重復性良好。

3 樣品測定

分別取何首烏生品及不同炮制品水提物樣品和何首烏生品及不同炮制品粉末，按“何首烏水提物供試溶液的制備”方法和“何首烏醇提物供試溶液的制備”方法制備供試溶液。按上述色譜條件，10μL注入色譜儀，按外標法計算何首烏生品及不同炮制品水提物和醇提物中游離蒽醌的含量。結(jié)果：樣品中未檢測出大黃酸與大黃酚。見表5，圖1-7。

表5 何首烏生品及不同炮制品大黃素含量測定結(jié)果

圖1 大黃素標品HPLC圖譜

圖2 大黃酸標品HPLC圖譜

圖3 大黃酚標品HPLC圖譜

圖4 何首烏生品水提物HPLC圖譜

圖5 何首烏生品醇提物HPLC圖譜

圖6 何首烏九蒸九曬水提物HPLC圖譜

圖7 何首烏九蒸九曬醇提物HPLC圖譜

4 結(jié) 果

本實驗采用HPLC法檢測何首烏生品及不同炮制品中大黃素含量，結(jié)果顯示：何首烏生品及不同炮制品水提物與醇提物中均含有大黃素，其水提物中清蒸何首烏大黃素含量最高，九蒸九曬何首烏含量最低，醇提物中生品何首烏大黃素含量最高，九蒸九曬何首烏大黃素含量最低。所有樣品未能檢測出大黃酸與大黃酚。實驗結(jié)果表明：九蒸九曬之何首烏蒸制時間較長，大黃素含量最低；而現(xiàn)代清蒸、黑豆汁制法時間較短，因而大黃素含量較高；而何首烏生品未經(jīng)系統(tǒng)炮制，大黃素含量最高。

5 討 論

目前多數(shù)學者認為，蒽醌類成分可能為何首烏中導致藥物性肝臟損傷的主要毒性成分[3]。衛(wèi)培峰等[4]在何首烏不同成分與肝細胞凋亡相關(guān)性研究中，將何首烏中蒽醌類成分提取物以及制首烏分別按不同劑量給予大鼠每天灌胃1次，連續(xù)3個月，檢測大鼠肝臟細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，給藥組與空白對照組比較，細胞凋亡指數(shù)明顯增高。胡錫琴等[5]通過制何首烏對大鼠的長期毒性實驗發(fā)現(xiàn)，給藥組對大鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT、ALP在不同階段均有一定的影響，對大鼠肝臟有一定的毒副作用，但屬于可逆轉(zhuǎn)損傷。譚凱麗等[6]通過文獻再評價認為，何首烏代謝產(chǎn)物可引起肝細胞脂質(zhì)過氧化致肝細胞壞死。而大黃素則為蒽醌類主要成分之一，因此根據(jù)大黃素含量測定結(jié)果可以推測，何首烏生品導致肝損傷的風險最高，而九蒸九曬組最低。而古代本草文獻之所以未記載有關(guān)制首烏導致藥物性肝損傷病例的發(fā)生，很可能與使用九蒸九曬后蒽醌類成分大幅度降低有關(guān)。

[1]俞 捷，謝 潔，趙榮華，等.何首烏肝臟不良反應研究進展[J].中草藥，2010，41（7）：1206-1210.

[2]孫桂波，紀鳳蘭，徐惠波，等.何首烏的化學成分與藥理作用研究進展[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2007，23（4）：105-106.

[3]方紅玫，朱廷焱.何首烏有效成分、毒性作用和相關(guān)研究進展[J].國際藥學研究雜志，2010，37（4）：283.

[4]衛(wèi)培峰，黨艷麗，焦晨莉，等.何首烏不同成分與肝細胞凋亡的相關(guān)性研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（2）：238-239.

[5]胡錫琴，楊曉青，邢玉瑞，等.制何首烏致肝損害的實驗研究[J].陜西中醫(yī)，2006，27（5）：625-626.

[6]譚凱麗，廖海民.何首烏的藥理作用研究進展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報，2010，29（1）：72-75.