周鑫 張瑩 韓廼珺 郭素萍 肖汀 程書鈞 高燕寧 張開泰

Elizabeth Hay于1968年提出上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的概念，并指出這種轉(zhuǎn)換在一定條件下是可以逆轉(zhuǎn)的[1]。事實(shí)上，EMT過程在后生動(dòng)物的整個(gè)生命周期中都起到重要作用，如發(fā)育、組織損傷修復(fù)、纖維化，以及某些病理過程（如惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移）[2]。最新的統(tǒng)計(jì)[3]顯示，肺癌死亡率仍高居各類癌癥之首。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）主要起源于上皮組織，因此大部分癌細(xì)胞維持上皮樣特性，小部分細(xì)胞會(huì)通過EMT獲得成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，失去胞間粘附并獲得移動(dòng)能力[4]。在分子水平上，這部分間質(zhì)樣細(xì)胞通常丟失E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、橋粒斑蛋白（Desmoplakin）和緊密連接蛋白（zonula occluden, ZO-1）等上皮樣細(xì)胞表面分子，而獲得間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin），伴隨著相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail和Slug的表達(dá)上調(diào)[5]。EMT是包含一系列精細(xì)復(fù)雜的變化，多種信號(hào)通路都參與其中，主要包括Wnt信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、磷脂酰肌醇激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K）信號(hào)通路、核因轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB, NF-κB）信號(hào)通路和ERK信號(hào)通路等；此外，還有多種microRNA參與這一過程的調(diào)控，如miR-155、miR-200和miR-205[6,7]。

除了肺癌，在諸如結(jié)腸癌[8]、胃癌[9]和乳腺癌[10]等多種實(shí)體瘤的研究中，都發(fā)現(xiàn)發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞具有更高的惡性程度。并且，原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT，常常預(yù)示著較差的臨床預(yù)后。一項(xiàng)針對(duì)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug的臨床研究[11]發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中其mRNA水平越高，患者的術(shù)后復(fù)發(fā)幾率越高，生存期越短。

相比于正常組織，腫瘤組織即使在有氧條件下糖酵解過程也明顯加強(qiáng)，并且相關(guān)酶類活性和表達(dá)水平都有所提高，即Warburg效應(yīng)[12]。隨后更多研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解過程相關(guān)酶類如己糖激酶（hexokinase-2, HK-2）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase-A, LDH-A）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH）和ENO1，實(shí)際上是具有包括催化活性在內(nèi)的多功能蛋白[13]。編碼ENO1的mRNA可以通過選擇性翻譯，表達(dá)另一種短異構(gòu)體c-Myc啟動(dòng)子結(jié)合蛋白1（c-Myc promoter binding protein-1, MBP-1）[14]。多種證據(jù)表明在乳腺癌[15]、NSCLC[16]、丙肝病毒相關(guān)肝細(xì)胞肝癌[17]、前列腺癌[18]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[19]中，ENO1和MBP-1都參與了癌癥的發(fā)展過程。在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中過表達(dá)MBP-1，可以抑制細(xì)胞的侵襲能力[15]。在胃癌中，ENO1和MBP-1可以通過抑制環(huán)氧合酶（cyclooxygenase-2, COX-2）表達(dá)抑制細(xì)胞EMT過程，從而抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[20]。目前，ENO1對(duì)肺癌細(xì)胞EMT的影響，沒有明確闡述。

本研究旨在揭示ENO1對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的EMT過程的影響，及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 野生型和突變型ENO1基因的克隆和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以人胚胎cDNA文庫作為模板，利用LATaq聚合酶（Takara，日本）克隆野生型ENO1全長(zhǎng)；并構(gòu)建至pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體（Invitrogen，美國(guó)）中。隨后，利用PCR引入點(diǎn)突變的方法，將野生型ENO1第94和97位氨基酸對(duì)應(yīng)密碼子ATG突變?yōu)镃TG。突變型ENO1m同樣構(gòu)建于pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體中。目的片段序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549（ATCC，美國(guó)），在含有10%胎牛血清的RPMI-1640（Invitrogen，美國(guó)）完全培養(yǎng)基中置于5%CO2、37oC條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國(guó)）產(chǎn)品說明書操作。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，替換含終濃度為600 μg/mL G418的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，并維持選擇壓力，從而獲得穩(wěn)定過表達(dá)ENO1的細(xì)胞亞群，命名為A549-ENO1。對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，命名為A549-Ctrl。

1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，在培養(yǎng)皿中均勻劃出三道劃痕。磷酸鹽緩沖液洗滌去除劃下的細(xì)胞。加入含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)，此時(shí)記為第0天，并拍照記錄。隨后，每隔24 h更換含2%胎牛血清的培養(yǎng)基并拍照記錄。

1.4 TGFβ-1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn) 當(dāng)細(xì)胞融合度在90%時(shí)，吸盡培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)饑餓24 h后，添加指定濃度TGFβ-1（R&D，美國(guó)）處理24 h，并拍照記錄。

1.5 EGF刺激實(shí)驗(yàn) 當(dāng)細(xì)胞融合度在50%-70%時(shí)，吸盡培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基饑餓4 h后，加入終濃度為20 ng/mL的EGF（Cell Signal，美國(guó)）處理1 h。

1.6 細(xì)胞總蛋白的提取和Western blot分析 以適量含有1%苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液（普利萊，中國(guó)）提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA Protein Assay Kit（Thermo，美國(guó)）進(jìn)行蛋白定量后用于Western blot分析。所用主要抗體及稀釋比：ENO1（1:1,500，奧維亞，中國(guó)）、ERK1/2（1:2,000，Santa Cruz，美國(guó)）、p-ERK1/2（1:1,000，Santa Cruz，美國(guó)）、p-MEK1/2（1:1,000，Cell Signal，美國(guó)）、E-cadherin（1:1,000，Santa Cruz，美國(guó)）、N-cadherin（1:1,000，BD，美國(guó)）、Vimentin（1:500，Santa Cruz，美國(guó)）和β-actin（1:5,000，Santa Cruz，美國(guó)）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖采用ImageJ2X（National Institutes of Health）采集數(shù)據(jù)，SPSS Statistics 17.0進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選穩(wěn)定過表達(dá)ENO1的A549細(xì)胞 收集篩選后的A549-ENO1和對(duì)照A549-Ctrl總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，A549-ENO1的ENO1表達(dá)水平更高（圖1）。

圖 1 Western blot鑒定外源性ENO1基因在A549細(xì)胞中的過表達(dá)Fig 1 The over-expression of exogenous ENO1 was examined by Western blot

2.2 過表達(dá)ENO1抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 劃痕24 h、48 h和72 h后，A549-ENO1劃痕僅愈合了19.6%、38.4%和63.4%，均低于對(duì)照組A549-Ctrl的34.5%、60.1%和85.9%（P＜0.05），表明ENO1過表達(dá)的A549細(xì)胞側(cè)向運(yùn)動(dòng)能力明顯下降（圖2A）。

2.3 過表達(dá)ENO1抑制EMT過程 相比于對(duì)照組，A549-ENO1細(xì)胞中上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯上升，間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)降低（圖2B）。TGFβ-1誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較高濃度的TGFβ-1（2 ng/mL）處理24 h才能使A549-ENO1群體中出現(xiàn)較多的成纖維樣細(xì)胞；對(duì)照組A549-Ctrl在低濃度TGFβ-1（0.5 ng/mL）處理24 h后即出現(xiàn)較多的成纖維樣細(xì)胞（圖2C）。該結(jié)果說明ENO1過表達(dá)可以對(duì)TGFβ-1誘導(dǎo)A549細(xì)胞的EMT過程產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

2.4 ENO1抑制ERK磷酸化 相比于A549-Ctrl，A549-ENO1中磷酸化的ERK1/2水平明顯下降（圖3A）。細(xì)胞血清饑餓4 h后，用終濃度為20 ng/mL的EGF同時(shí)處理1 h后發(fā)現(xiàn)，A549-ENO1細(xì)胞中磷酸化的ERK1/2明顯低于對(duì)照組，而MEK1/2的磷酸化幾乎不受影響（圖3B）。因此，我們推測(cè)ENO1可以通過抑制ERK1/2的磷酸化來抑制A549細(xì)胞的EMT。

2.5 全長(zhǎng)ENO1可以抑制EMT 野生型ENO1wt在第94和97位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的密碼子是ATG，定點(diǎn)突變型ENO1m在對(duì)應(yīng)位置為CTG（圖4A）。將野生型ENO1、突變型ENO1和空載質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)MBP-1表達(dá)沒有明顯的升高，并且突變型ENO1所產(chǎn)生的效應(yīng)同野生型ENO1幾乎完全相同（圖4B）。這表明全長(zhǎng)ENO1蛋白可以阻礙EMT過程。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室利用新型蛋白質(zhì)組研究體系建立了肺癌相關(guān)分泌/釋放蛋白數(shù)據(jù)庫，其中包含了ENO1在內(nèi)的糖酵解途徑關(guān)鍵酶[21]；并且檢測(cè)到在NSCLC患者和正常對(duì)照組外周血中，ENO1蛋白水平具有明顯差異，因此，我們推測(cè)ENO1可能同NSCLC的發(fā)展具有密切聯(lián)系[22]。本實(shí)驗(yàn)則針對(duì)ENO1在NSCLC細(xì)胞的EMT過程中的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。

本研究在A549細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定過表達(dá)ENO1，發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變和抑制ERK1/2磷酸化的現(xiàn)象，并導(dǎo)致A549細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力下降。對(duì)比圖2C中未添加TGFβ-1處理的細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ENO1會(huì)引起A549細(xì)胞形態(tài)更趨近于上皮樣細(xì)胞的變化，而對(duì)照組細(xì)胞更多地呈現(xiàn)出間質(zhì)樣細(xì)胞的梭形特征。根據(jù)這些現(xiàn)象，我們提出了ENO1通過抑制ERK1/2磷酸化來抑制EMT的假設(shè)。隨后的TGFβ-1誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)和EGF刺激ERK1/2活化的實(shí)驗(yàn)，均證實(shí)了這個(gè)假設(shè)。

在糖酵解過程中的很多酶都是多功能性的蛋白[13]。ENO1在不同的組織細(xì)胞中不同的生理和病理狀態(tài)下，甚至是在不同的細(xì)胞亞定位均能夠顯示出不同的功能[23]。Hsu等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中的ENO1/MBP-1可以作為轉(zhuǎn)錄因子降低COX-2的轉(zhuǎn)錄水平，抑制胃癌細(xì)胞的EMT。對(duì)ENO1在NSCLC中抑制EMT的作用仍然沒有解釋清楚。

圖 2 ENO1對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和EMT的抑制作用。A：劃痕實(shí)驗(yàn)：在劃痕后第24 h、48 h和72 h連續(xù)觀察，過表達(dá)ENO1的A549細(xì)胞劃痕恢復(fù)能力明顯下降（*t檢驗(yàn)，P＜0.05）。圖表縱坐標(biāo)表示劃痕寬度相對(duì)0 h時(shí)劃痕寬度比，橫坐標(biāo)表示時(shí)間；B：Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于A549-Ctrl，A549-ENO1細(xì)胞中，E-cadherin表達(dá)明顯增加，N-cadherin和Vimentin表達(dá)量明顯降低；C：梯度TGFβ-1誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)：低劑量（0.5 ng/mL）處理A549-Ctrl細(xì)胞即可出現(xiàn)大量間質(zhì)樣細(xì)胞，而A549-ENO1細(xì)胞需要較高劑量（2 ng/mL）處理才能出現(xiàn)一定數(shù)量的間質(zhì)樣細(xì)胞。Fig 2 ENO1 inhibits A549 cell mobility and EMT process. A: Wound-healing assay: a continuous observation showed that over-expression of ENO1 resulted in limitation of A549 mobility (*t-test, P＜0.05). In the chart, Y-axis represents the relative wound width and X-axis represents time period; B:Western blot assay: compared to A549-Ctrl, E-cadherin up-regulated in A549-ENO1, with down-regulation of N-cadherin and Vimentin; C: gradient dose of TGFβ-1 inducing EMT: quantity of mesenchymal-like cells were obtained in A549-Ctrl population after low dose (0.5 ng/mL) of TGFβ-1 inducing. Relative lower ratio of mesenchymal-like cells formed in A549-ENO1 population after high dose (2 ng/mL) of TGFβ-1 treatment.

圖 3 ENO1抑制A549細(xì)胞ERK1/2的磷酸化。A：同對(duì)照組相比A549-ENO1細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平明顯受限；B：20 ng/mL的EGF處理細(xì)胞，A549-ENO1的ERK1/2磷酸化水平仍然明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，而MEK1/2磷酸化活化幾乎不受影響。Fig 3 ENO1 suppresses ERK1/2 phosphorylation in A549. Western blot result showed: A: Compared to A549-Ctrl group, ERK1/2 phosphorylation was inhibited by ENO1 over-expression; B: ERK1/2 phosphorylation level of A549-ENO1 was still lower than that of control group after EGF treatment, whereas MEK1/2 phosphorylation was almost not affected by ENO1 over-expression.

本研究結(jié)果顯示全長(zhǎng)ENO1蛋白本身具有抑制EMT的效應(yīng)。為了排除MBP-1的干擾，我們構(gòu)建了在ATG密碼子處不產(chǎn)生選擇性翻譯MBP-1的突變型ENO1，并檢測(cè)到過表達(dá)野生型ENO1和突變型ENO1在蛋白水平上對(duì)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的改變作用幾乎完全相同。而MBP-1對(duì)ERK信號(hào)通路的影響，則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖 4 野生型和點(diǎn)突變ENO1具有相同作用。A：序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)ENO1突變型存在兩個(gè)ATG→CTG；B：Western blot檢測(cè)顯示出瞬時(shí)過表達(dá)野生型和突變型ENO1對(duì)E-cadherin、N-cadherin、p-ERK1/2變化影響是相似的。Fig 4 Wild type and point mutant ENO1 have the same effect.A: Sequence comparison: two point mutation ATG-＞CTG existed in mutant ENO1; B: Western blot assay: highly similar effect on E-cadherin, N-cadherin and p-ERK1/2 appeared after transient overexpression of wild type and mutant ENO1 in A549.

本研究不僅初步證實(shí)了ENO1的多功能性，為“糖酵解相關(guān)酶是多功能蛋白”的理論提供了新證據(jù)，而且也從影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的角度揭示ENO1抑制EMT的分子機(jī)理。經(jīng)典的MAPK通路涉及到了Raf1→MEK1/2→ERK1/2的信號(hào)傳遞和放大過程[24]，磷酸化的ERK1/2激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和c-Fos表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MMP-2等基因表達(dá)，降解胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[25]。當(dāng)細(xì)胞接受MEK1/2特異性抑制劑U0126處理后，ERK1/2信號(hào)通路被阻斷，弱化TGFβ誘導(dǎo)EMT的效果，表明ERK1/2通路的活化是細(xì)胞EMT過程的一個(gè)必要條件[7]。ERK1/2的第204/187位酪氨酸殘基和MEK1/2第218/222位絲氨酸殘基的磷酸化，分別指示了這兩種激酶的活化狀態(tài)，并且MEK1/2是目前已知唯一能夠活化ERK1/2的激酶[26,27]?；谶@些條件，本實(shí)驗(yàn)分析了ENO1的過表達(dá)對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的影響，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即ENO1過表達(dá)引起活性狀態(tài)的ERK1/2降低，而不影響MEK1/2活化。在另外一個(gè)研究[18]中，研究人員發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞中MBP-1可以通過同MEK5的直接相互作用抑制MEK5/BMK1的非經(jīng)典MAPK信號(hào)通路。因此，我們推測(cè)在ERK1/2磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)過程中，ENO1可能通過某種機(jī)制抑制了MEK1/2的催化活性，但不會(huì)影響MEK1/2的活化；也有可能是ENO1過表達(dá)，增強(qiáng)了PTPs和MKPs等磷酸酶活性，但這些推論需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來支持。