韓春錫 林婧嫻 吳維青 陳盼盼 謝建生 廖建湘

杜氏型肌營養(yǎng)不良( DMD) 是以肌纖維變性、壞死、再生及間質(zhì)結(jié)締組織增生為主要病理特點(diǎn)，以進(jìn)行性肌無力，肌肉萎縮為主要臨床特征的X 連鎖隱性遺傳性疾?。?，2］。大量肌纖維的壞死，使肌纖維內(nèi)的CK、AST 和ALT 釋放到血液中，導(dǎo)致血清肌酶升高［3，4］。嬰幼兒DMD 的運(yùn)動(dòng)發(fā)育尚未成熟，皮下脂肪豐富，缺乏肌無力、肌萎縮等典型臨床表現(xiàn)，大多僅表現(xiàn)為血清CK、AST 或ALT 水平升高，往往被誤診為“心肌炎”或“肝炎”，實(shí)施不必要的輔助檢查，包括創(chuàng)傷性肝穿刺等［5～9］，失去早期診斷、治療和接受遺傳咨詢的良機(jī)［10，11］。本研究通過分析嬰幼兒DMD 的臨床表現(xiàn)、血生化、基因以及骨骼肌病理特征，為早期診斷嬰幼兒DMD 提供依據(jù)。

1 方法

1.1 DMD 的診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前尚缺乏嬰幼兒DMD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但鑒于DMD 基因突變檢測可為臨床診斷提供直接和可靠的依據(jù)［2，12］，DMD 骨骼肌病理改變是引起臨床癥狀、體征的基礎(chǔ)［2，13］。本研究中診斷嬰幼兒DMD，至少滿足以下2 項(xiàng)中任意1 項(xiàng)方可診斷：①DMD 基因發(fā)生移碼突變，同時(shí)伴有運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、走路不穩(wěn)和易摔倒等臨床表現(xiàn)；②DMD 基因突變不伴有DMD 臨床表現(xiàn)時(shí)，須通過肌活檢證實(shí)dystrophin 完全缺失。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 深圳市兒童醫(yī)院( 我院) 從2009 年6月起對在神經(jīng)肌肉病專科門診就診的患兒進(jìn)行隨訪觀察，故本研究納入2009 年6 月至2013 年3 月在?？崎T診首診、未在外院接受過糖皮質(zhì)激素治療、通過DMD 基因檢查和( 或) 肌活檢確診為DMD 的男性嬰幼兒。

1.3 分組 為觀察患兒運(yùn)動(dòng)發(fā)育與血清CK、AST、ALT 之間的關(guān)系，本研究依據(jù)患兒首診年齡分為4 組：0 ～6、～12、～24 和～36 月齡組。

1.4 血清CK、AST 和ALT 檢測 首診時(shí)采集非抗凝靜脈血2.0 mL，于我院常規(guī)檢測CK、ALT 和AST 水平，正常值分別為：CK 25 ～175 U·L-1，AST 0 ～40 U·L-1，ALT 0 ～40 U·L-1。

1.5 肌電圖及神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查 使用Nicolet 肌電圖儀( Viking ⅣP，美國) ，檢測正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、腓總神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肱二頭肌、股內(nèi)肌、腓腸肌的同心圓針EMG，包括安靜狀態(tài)下插入電位、自發(fā)電位，輕收縮時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)限、波幅和多相波百分比以及重收縮時(shí)運(yùn)動(dòng)單位的募集相型和波幅。

1.6 DMD 基因檢查［12，14］采集靜脈血2.0 mL，EDTA 抗凝，磁珠吸附法提取基因組DNA( Lab-Aid 基因組DNA 分離試劑盒，廈門致善生物科技有限公司) ，MLPA 法( MLPA P034/P035 試劑盒，MRC-HOLLAND 公司) 檢測DMD 基因79 個(gè)外顯子的缺失或重復(fù)。對未發(fā)現(xiàn)外顯子異常的患兒進(jìn)行DMD 全基因測序，檢測點(diǎn)突變。

1.7 肌肉活檢［2，15］對非移碼缺失突變、重復(fù)突變、點(diǎn)突變以及雖是移碼缺失突變，但缺乏DMD 臨床癥狀的患兒進(jìn)行肌肉活檢。在利多卡因局部麻醉下取左腓腸肌組織0.5 cm×0.5 cm ×0.6 cm，制成8 μm 厚冰凍切片，實(shí)施常規(guī)組織化學(xué)和組織酶學(xué)染色，采用抗dystrophin-C 末端、N-末端、中央棒狀區(qū)的單克隆抗體1∶100 稀釋( Novocastra 公司，美國) ，實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。病理切片由我院神經(jīng)肌肉病研究室2 名專業(yè)醫(yī)生讀片。

1.8 隨訪 根據(jù)患兒年齡，每3 個(gè)月至1 年來我院門診隨訪，6 月齡起隨訪運(yùn)動(dòng)發(fā)育狀況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊時(shí)采用Wiilconxon Signed Ranks 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共納入男性DMD 患兒43 例，其中門診患兒17 例，住院患兒26 例。就診年齡1 ～34( 18.2 ±11.3)月齡。0 ～6 月齡組7 例，～12 月齡組9 例，～24 月齡組8例，～36 月齡組19 例。

對36 例患兒進(jìn)行了總體運(yùn)動(dòng)發(fā)育評估，其中31 例(86.1%) 出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)發(fā)育延遲，平均(8.6 ±2.4) 個(gè)月時(shí)會(huì)獨(dú)坐，(18.6 ±4.9) 個(gè)月時(shí)會(huì)獨(dú)立行走。對24 例患兒進(jìn)行了粗大和精細(xì)運(yùn)動(dòng)發(fā)育評估，其中20 例( 83.3%) 在運(yùn)動(dòng)發(fā)育過程中不會(huì)或不愿意爬行運(yùn)動(dòng)，行走時(shí)左右搖擺，呈鴨步，易跌倒；與同年齡幼兒相比，不能雙腳蹦跳，扶著東西上樓梯，地上撿東西時(shí)不完全彎曲膝關(guān)節(jié)，單手或雙手扶著膝蓋緩慢站立。對19 例患兒進(jìn)行了語言能力評估，其中5 例(26.3%) 表現(xiàn)為吐字不清。

2.2 就診原因 43 例DMD 患兒中，因上呼吸道感染，查血清CK 和轉(zhuǎn)氨酶水平升高就診者分別有21 例( 48.8%)和13 例(30.2%) ，其中誤診為心肌炎14 例，原因不明的高CK 血癥7 例；因入托體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)ALT 升高誤診為肝炎就診13 例( 30. 2%) ； 因 單 純 運(yùn) 動(dòng) 發(fā) 育 遲 緩 就 診6 例(14.0%) ；有DMD 家族史并伴有運(yùn)動(dòng)障礙，高度懷疑DMD就診3 例(7.0%) 。

2.3 肌力和肌容積的改變 4 個(gè)年齡組的上肢肌力及0 ～6、～12 月齡組患兒的下肢肌力均基本正常。～24 月齡組6/9 例和～36 月齡組所有患兒的下肢近端肌力均為Ⅴ-( 未能蹲起自如) ?！?4 和～36 月齡組患兒均有股外側(cè)肌和( 或) 腓腸肌的假性肥大及不同程度的肌肉硬度改變。所有年齡組患兒均未見明顯肌萎縮。

2.4 血清CK、AST 和ALT 水平 首診時(shí)43 例DMD 患兒血清CK、AST 和ALT 水平均明顯高于正常值?！?2、～24和～36 月齡組血清CK 和ALT 水平較0 ～6 月齡組升高( P分別為0.02、002 和0.001) ，～12、～24 和～36 月齡組間血清CK、AST 和ALT 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均P ＞0.05)( 表1) 。

2.5 DMD 基因檢測 43 例DMD 患兒均采用MLPA 法檢測DMD 基因79 個(gè)外顯子的缺失或重復(fù)，其中移碼缺失突變29 例(67.4%) ，非移碼缺失突變2 例( 4.6%) ，單純重復(fù)突變4 例(9.3%) ，重復(fù)和缺失同時(shí)存在1 例( 2.3%) 。7 例(16.3%) 未發(fā)現(xiàn)外顯子缺失或重復(fù)，實(shí)施DMD 全基因測序，均發(fā)現(xiàn)有害點(diǎn)突變。

表1 嬰幼兒DMD 患兒不同年齡組血清CK、AST、ALT 水平( U·L -1) 比較( x±s)Tab 1 Comparison of serum CK，AST，ALT activity( U·L -1) among different infant DMD groups( x±s)

2.6 肌肉活檢 16 例進(jìn)行肌肉活檢。光鏡下均可見大量萎縮、變性、壞死肌纖維及再生肌纖維( 圖1A) ，間質(zhì)脂肪結(jié)締組織增生( 圖1B) ，符合肌營養(yǎng)不良樣病理改變，但很少見到特大的肥大肌纖維、斷裂肌纖維以及環(huán)狀改變的肌纖維。壞死肌纖維周圍均可見不同程度的炎細(xì)胞浸潤。16例患兒肌纖維膜上抗肌萎縮蛋白-C、N 單克隆抗體的免疫染色均表達(dá)缺失( 圖1C ～E) ，偶見抗肌萎縮蛋白-R 示弱陽性。免疫染色陽性對照抗肌萎縮蛋白表達(dá)正常( 圖1F) 。

2.7 肌電圖及神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查 12 例進(jìn)行了肌電圖檢查，神經(jīng)傳導(dǎo)速度均正常，其中8 例表現(xiàn)為放松時(shí)未見失神經(jīng)電位，輕收縮時(shí)運(yùn)動(dòng)單位平均時(shí)限變窄、波幅降低，強(qiáng)收縮時(shí)呈混合相，提示肌源性損害。

圖1 DMD 患兒骨骼肌病理變化和抗肌萎縮蛋白免疫染色( ×200)Fig 1 Pathological changes of skeletal muscle and immunohistochemical staining with antibodies to dystrophin ( ×200)

3 討論

DMD 患兒的骨骼肌損傷是由軀干和四肢近端開始緩慢發(fā)展，表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性肌無力，肌萎縮伴腓腸肌的假性肥大，下肢受累重于上肢［1，2］。由于髂腰肌和下肢近端肌肉受累早且重，因此患兒由仰臥位站立時(shí)，用手支撐軀干呈俯跪位，接著以雙手順次支撐雙足背、膝部等處，方能站立，即Gower 征陽性。然而，嬰幼兒期DMD 患兒常缺乏典型的陽性Gower 征，僅表現(xiàn)為開始端坐、獨(dú)站和行走的年齡延遲，行走時(shí)兩側(cè)搖擺，呈鴨步或行走易跌倒，或從地上撿東西時(shí)不全屈曲膝關(guān)節(jié)，僅用彎腰動(dòng)作來完成。多數(shù)患兒不能或不愿意爬行，而這些臨床表現(xiàn)均提示患兒的骨盆帶肌和下肢近端肌肉受累，但常未能引起患兒家屬或醫(yī)生的重視，被誤認(rèn)為患兒的行為習(xí)慣異?；蜇E病的表現(xiàn)［5，9］。本研究發(fā)現(xiàn)，生后1 ～2 個(gè)月的DMD 嬰兒雖然缺乏肌無力和肌萎縮表現(xiàn)，但在扶著患兒站立狀態(tài)下可觸及股外側(cè)肌和腓腸肌的肌肉硬、韌，是早期診斷DMD 的重要體征，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。如果嬰兒早期出現(xiàn)肌無力、肌張力低下和肌萎縮等典型的神經(jīng)肌肉病表現(xiàn)，則不應(yīng)考慮DMD，而應(yīng)考慮先天性肌病、先天性肌營養(yǎng)不良、糖原累積病以及腦和脊髓疾病引起的松軟兒等［16］。

肌電圖檢查有助于鑒別肌源性損傷或神經(jīng)源性損傷。但在嬰兒DMD 的肌電圖檢查中，因患兒的運(yùn)動(dòng)單位電位幅度小，檢查不配合，因此要單純鑒別骨骼肌是否發(fā)生神經(jīng)源性損害還是肌源性損害，肌電圖的檢查意義不如檢測血清CK、AST 和ALT 水平，血清CK、AST 和ALT 成比例升高，直接提示骨骼肌發(fā)生肌源性損害，但心肌酶正常不能排除骨骼肌的肌源性損害。一般情況下，骨骼肌發(fā)生神經(jīng)源性損害時(shí)，心肌酶正?；蜉p微升高。

本研究中，患兒就診原因?yàn)镃K 和AST、ALT 升高占79%。然而，馮善偉等［17］對436 例( 平均年齡為9.7 歲)DMD 患兒的臨床研究結(jié)果表明，就診主要原因?yàn)樽呗防щy易摔倒(42%) 和上樓梯困難(38%) ，提示不同年齡段患兒的就診原因各不相同，不明原因的血清CK、AST、ALT 升高是診斷嬰幼兒DMD 的重要線索［18，19］。由于骨骼肌組織中均含有豐富的CK、AST 和ALT，因此當(dāng)發(fā)生肌纖維組織損傷時(shí)血清CK、AST 和ALT 均明顯升高，其中以CK 的變化最為敏感［20，21］。本研究結(jié)果顯示，0 ～6 月齡組血清CK 水平超過正常值上限的50 倍以上，而～12 月齡組血清CK 水平可達(dá)正常值上限的140 倍。提示： ①DMD 嬰兒早期，雖然尚未出現(xiàn)明顯的肌無力、肌萎縮等表現(xiàn)，但患兒體內(nèi)已開始發(fā)生肌纖維的大量破壞；②～12 月齡組血清CK 水平升高最顯著，可能與患兒活動(dòng)量增加有關(guān)，但可能還有其他因素參與肌纖維的損傷過程［20～24］，有必要進(jìn)一步探討； ③嬰幼兒DMD 血清CK 水平雖然有波動(dòng)，但始終維持在較高水平，表明患兒的肌纖維破壞有可能持續(xù)發(fā)生。

本研究患兒血清CK 水平的升高總是伴隨著AST 和ALT 水平的升高，這種變化特點(diǎn)不同于骨骼肌外傷或其他組織細(xì)胞損傷，如肝炎、心肌炎等引起的血清酶改變。骨骼肌外傷或心肌炎引起的CK 升高，往往隨著病因的消除，其CK 水平也逐漸恢復(fù)至正常，同時(shí)伴有相應(yīng)疾病的癥狀和體征，如骨骼肌外傷史或心臟功能異常以及心電圖的改變等。雖然，肝炎患兒也可出現(xiàn)AST 和ALT 升高，但一般不會(huì)伴有CK 的明顯升高。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)男性嬰幼兒出現(xiàn)原因不明的血清CK、AST 和ALT 伴隨升高時(shí)，應(yīng)注意肌營養(yǎng)不良的可能，即使是缺乏DMD 臨床癥狀，也有必要進(jìn)行DMD基因檢測協(xié)助診斷［19］。由于DMD 外顯子的缺失或重復(fù)只占DMD 基因突變的70%左右，因此高度懷疑DMD，但仍未發(fā)現(xiàn)外顯子的缺失或重復(fù)時(shí)，應(yīng)該實(shí)施DMD 全基因測序或肌活檢。

當(dāng)發(fā)生DMD 基因突變，但并不改變翻譯閱讀框架( 即非移碼突變)［16］，則臨床上并不表現(xiàn)為典型的DMD，而表現(xiàn)為癥狀較輕的貝克型肌營養(yǎng)不良( BMD) 。因此，一般情況下只要發(fā)生移碼突變，不管是外顯子的缺失、重復(fù)還是點(diǎn)突變，嬰幼兒DMD 的臨床表現(xiàn)都較類似，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)發(fā)育延遲，走路不穩(wěn)容易摔倒。但部分外顯子的非移碼突變可導(dǎo)致DMD，詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。肌活檢是診斷和鑒別診斷肌病的重要手段，但肌活檢不是診斷DMD 的絕對適應(yīng)證［18］。如嬰幼兒期已經(jīng)出現(xiàn)DMD 的臨床表現(xiàn)，同時(shí)檢測到DMD 外顯子缺失或重復(fù)，并通過DMD 結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫( eDystrophin online database) 查找基因突變屬于移碼突變，就可確診DMD［13］。本研究結(jié)果表明，DMD 嬰幼兒骨骼肌中已經(jīng)發(fā)生肌纖維的大量萎縮、變性、壞死、再生以及脂肪結(jié)締組織增生等較典型肌營養(yǎng)不良的病理改變，提示早期干預(yù)嬰幼兒DMD 的必要性。

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