胡 芳 張惠君 王 亮 佟淑敏

(1.齊齊哈爾大學(xué)輕工與紡織學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾，161006;2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾，161006)

殼聚糖是一種天然的氨基多糖，無色、無味、無毒，并具有良好的抑菌性、成膜性和生物降解性，是一種天然的抗菌材料，因此近年來在食品、果蔬保鮮領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用受到人們的重視。許多學(xué)者對殼聚糖的抗菌機理進行了研究，提出了多種結(jié)論，現(xiàn)概括如下:①殼聚糖能夠結(jié)合一些微生物正常生長所必需的微量元素、金屬元素或營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制微生物生長［1］，其中的氨基基團是主要的作用位點，羧甲基化能夠增強殼聚糖衍生物對金屬離子的吸附能力［2-3］。②在酸性條件下，殼聚糖分子中的質(zhì)子化銨—N具有正電性，使細菌細胞壁和細胞膜上的負電荷分布不均，干擾細胞壁的合成，打破了在自然狀態(tài)下的細胞壁合成與溶解平衡，使細胞壁趨向于溶解，細胞膜因不能承受滲透壓而變形破裂，細胞的內(nèi)容物如水、蛋白質(zhì)等滲出，發(fā)生細菌溶解而死亡［4］。Chung等人［5-6］的研究證實殼聚糖對細菌的抗菌作用是一個連續(xù)兩步的作用機制，首先將細胞壁與細胞膜分離，之后破壞細胞膜。③低分子質(zhì)量殼聚糖可透過微生物細胞壁進入到細胞，尤其是革蘭氏陰性菌(細胞壁較薄、肽聚糖交聯(lián)松散)的內(nèi)部，與DNA形成穩(wěn)定的混合物，干擾DNA聚合酶或RNA聚合酶的作用，阻礙DNA或RNA的合成，從而抑制微生物繁殖［7-9］。④高分子質(zhì)量殼聚糖溶于酸后，成為一種陽離子型生物絮凝劑，在絮凝過程中使菌體細胞聚沉，高分子鏈密集于細菌菌體表面，形成一層高分子膜，影響細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻止代謝廢物的排泄，導(dǎo)致菌體的新陳代謝紊亂，從而起到殺菌和抑菌的作用［10］。

同時，殼聚糖的抗菌機制也因菌種的不同而不同［11-12］。對于革蘭氏陽性菌來說，殼聚糖的抗菌機制是:殼聚糖引起細菌細胞的表面發(fā)生變化，并在細胞膜上形成多孔結(jié)構(gòu)，進而與細胞膜結(jié)合，使其失去屏障功能，最終達到抗菌的效果。對于革蘭氏陰性菌，殼聚糖主要通過滲透進入到細菌體內(nèi)，吸附其離子物質(zhì)，干擾細胞代謝來達到抑制細菌的目的。殼聚糖及其衍生物在造紙工業(yè)中的研究和應(yīng)用已有幾十年的歷史，例如作為助留劑［13-14］、增強劑［15-16］、表面施膠劑［17-18］等。目前關(guān)于殼聚糖及其衍生物作為抗菌劑在抗菌紙中的研究和應(yīng)用正引起人們的重視。本研究中采用的菌種是金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，是一種革蘭氏陽性菌，是人類常見的致病菌之一。選擇該菌種是希望能夠證實本研究中制備的抗菌紙對這類細菌的作用效果，關(guān)于產(chǎn)品對革蘭氏陰性菌作用效果的研究，將另見報道。

1 實驗

1.1 實驗原料

殼聚糖，相對分子質(zhì)量分別為5萬、20萬、50萬、80萬、100萬，青島舜博生物技術(shù)研究所有限公司提供;變性淀粉，天津頂峰淀粉開發(fā)有限公司提供;原紙，定量為70 g/m2。金黃色葡萄球菌;乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖-淀粉抗菌涂布液的制備

稱取一定量殼聚糖粉末于燒杯中，加入一定量的乙酸，在磁力攪拌器上、45℃下攪拌直到殼聚糖完全溶解。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值。

稱取一定量的淀粉放入三口燒瓶中，加入一定量的蒸餾水后在恒溫水浴鍋中以80℃進行糊化。

最后將糊化好的淀粉加入到殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌，得到柔軟、透明、均一的殼聚糖-淀粉抗菌涂布液。

1.2.2 殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙的制備

利用YZ-2300涂布機進行涂布處理，得到殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙。

1.2.3 殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙的強度性能檢測

將已經(jīng)制備好的殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙裁切成適當(dāng)?shù)某叽?，利用DC-K2300C電腦測控抗張實驗機測定抗菌紙的抗張指數(shù)。

1.2.4 殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙的抗菌性能檢測

將涂布后的紙張截切成直徑為1 cm的圓紙片，分裝于潔凈干燥的試管中，塞好塞子，用報紙包好;將實驗所需的培養(yǎng)皿、移液管、試管用報紙包好;在高壓蒸汽式滅菌鍋內(nèi)濕熱滅菌 (121℃，20 min)，備用。

把預(yù)先進行菌種活化的菌種挑取1～2環(huán)，接入裝有1 mL滅菌水的試管中，充分混勻制成菌懸浮液。

用已滅菌的量筒量取15 mL事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基迅速倒入培養(yǎng)皿 (平板)中，平鋪均勻，放置一段時間使其凝固，備用。用滅菌膠頭滴管吸取已制備好的菌株懸浮液0.2 mL接種于平板上，用滅菌涂布輥涂勻。

將已滅菌的小圓紙片分別用鑷子夾出平鋪于已涂布菌液的平板中。對照樣同法操作。

將平板分別置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，利用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大?。?9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 涂布液中殼聚糖濃度對涂布抗菌紙抗菌性能及

抗張強度的影響

在研究涂布液中殼聚糖濃度對紙張性能的影響時，涂布液中淀粉濃度為20 g/L，乙酸用量為1%(相對于涂布液體積)，pH值為5，殼聚糖的相對分子質(zhì)量為100萬，涂布量為0.96 g/m2。殼聚糖濃度對涂布抗菌紙的抑菌圈直徑及抗張指數(shù)的影響如圖1所示，其中對照樣無抑菌效果。

圖1 殼聚糖濃度對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

由圖1可以看出，隨著殼聚糖濃度的增加，抑菌圈直徑增大，當(dāng)殼聚糖濃度超過15 g/L后，抑菌圈直徑減小。殼聚糖的抗菌能力隨其濃度增加而增強，原因歸結(jié)為殼聚糖中—NH2的存在。隨著殼聚糖濃度的不斷增加，溶液中—NH2的濃度也將逐漸增加，從而抗菌效果也增強。但過高的用量會造成殼聚糖大分子的纏結(jié)增強，故抗菌能力下降［19］。

由圖1還可以看出，在殼聚糖濃度為20 g/L時，抗張指數(shù)最好。當(dāng)殼聚糖濃度過高時，涂布液黏度增大，造成涂布液在紙張表面分布不均勻，因此抗張指數(shù)下降。綜合涂布液中殼聚糖濃度對涂布抗菌紙抗菌性能和抗張強度的影響，確定在制備抗菌涂布液時，殼聚糖的適宜濃度為15 g/L。

2.2 涂布液中淀粉濃度對涂布抗菌紙抗菌性能及抗

張強度的影響

在研究涂布液中淀粉濃度對紙張性能的影響時，涂布液中殼聚糖的濃度為15 g/L，乙酸用量為1%，pH值為5，殼聚糖的相對分子質(zhì)量為100萬，涂布量為0.96 g/m2，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 淀粉與殼聚糖濃度之比對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

由圖2可以看出，隨涂布液中淀粉與殼聚糖濃度之比的增大，涂布抗菌紙的抑菌圈直徑先增大后減小，當(dāng)?shù)矸叟c殼聚糖的濃度之比為1.5∶1.0時，抑菌圈直徑達到最大值，此時殼聚糖的抑菌效果最好，同時涂布抗菌紙抗張強度也接近最大值。當(dāng)?shù)矸鄣臐舛容^小時，制得的抗菌液黏度較大，造成殼聚糖分子纏結(jié)增強，影響其抗菌性能。而當(dāng)?shù)矸蹪舛冗^高時，單位紙張面積上殼聚糖分子的數(shù)量減少，使抗菌性能下降。紙張的抗張指數(shù)隨著淀粉濃度的增加而增加，這是因為隨著淀粉濃度的增大，殼聚糖分子中的羥基和氨基，與淀粉分子鏈的物理交聯(lián)越來越充分［20］;且殼聚糖分子中的羥基與氨基同淀粉分子間以及紙張纖維間形成氫鍵的作用越來越強烈，但當(dāng)?shù)矸叟c殼聚糖的濃度之比超過1.5∶1.0時，抗張指數(shù)的變化不再明顯。

2.3 涂布液中乙酸用量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張強度的影響

在研究涂布液中乙酸用量對紙張性能的影響時，涂布液中殼聚糖的濃度為15 g/L，淀粉與殼聚糖的濃度之比為1.5∶1.0，pH值為5，殼聚糖的相對分子質(zhì)量為100萬，涂布量為0.96 g/m2，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙酸用量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

從圖3可以看出，乙酸用量不斷增大，紙張的抑菌圈直徑也增大，當(dāng)乙酸用量為1.5%時，紙張的抑菌效果最好，之后隨著乙酸用量的增加，抑菌圈直徑逐漸減小。乙酸用量越高，殼聚糖溶解所需的時間越短，溶解的效果越好。但過量的酸根離子起到靜電屏蔽的作用而使單個高分子無規(guī)線團緊縮，從而暴露出來的—NH+3減少，降低了抗菌性能［21］。

涂布抗菌紙的抗張指數(shù)隨著乙酸用量的增大而增大，在乙酸用量為2.0%時，涂布抗菌紙的抗張指數(shù)達到最大值，隨后下降。綜合乙酸用量對涂布抗菌紙抗菌性能和機械強度的影響，確定在制備抗菌涂布液時，乙酸用量為1.5%較佳。

2.4 涂布液pH值對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張強

度的影響

在研究涂布液pH值對紙張性能的影響時，涂布液中殼聚糖的濃度為15 g/L，淀粉與殼聚糖的濃度之比為1.5∶1.0，乙酸用量為 1.5%，殼聚糖的相對分子質(zhì)量為100萬，涂布量為0.96 g/m2。

圖4 pH值對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

由圖4可見，隨著pH值的增大，紙張的抑菌圈直徑逐漸增大，當(dāng)pH值為5時，抑菌圈直徑最大，隨后抑菌圈直徑隨pH值的增加而下降，當(dāng)pH值為7時幾乎不具有抗菌能力。殼聚糖是一種弱堿性聚電解質(zhì)，殼聚糖在酸性介質(zhì)中，—NH2接受H+，形成殼聚糖質(zhì)子化產(chǎn)物，呈現(xiàn)出陽離子聚合物的性質(zhì)，改變了細菌膜表面的正、負電荷分布，導(dǎo)致細胞膜弱化與破壞，引起細胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，最后死亡。隨pH值的升高，殼聚糖的溶解性和質(zhì)子化程度降低，抗菌能力逐漸減弱，pH值大于7時殼聚糖不再具有抗菌能力。同樣，隨著pH值的升高，由于殼聚糖的溶解性和質(zhì)子化程度降低，殼聚糖與淀粉以及殼聚糖與紙張纖維之間的鍵合能力也減小。當(dāng)pH值過低時，溶液中的大量H+與—NH+3在細菌表面產(chǎn)生競爭性吸附，同樣造成抗菌性能下降［22］。同時，過低的pH值會促進殼聚糖大分子的降解，造成紙張抗張指數(shù)下降。

2.5 殼聚糖相對分子質(zhì)量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張強度的影響

在研究殼聚糖相對分子質(zhì)量對紙張性能的影響時，涂布液中殼聚糖的濃度為15 g/L，淀粉與殼聚糖的濃度之比為1.5∶1.0，乙酸用量為 1.5%，pH 值為5，涂布量為0.96 g/m2，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 殼聚糖相對分子質(zhì)量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

由圖5可知，殼聚糖相對分子質(zhì)量在20萬時抑菌圈直徑最大，即相對分子質(zhì)量為20萬的殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。殼聚糖的相對分子質(zhì)量越大，涂布液的黏度越大，因此分子鏈就越容易纏繞而使分子鏈更加僵硬，這樣就減少了有效的—N離子濃度，削弱了有效的抗菌基團與細菌充分接觸的空間，因此殼聚糖的抗菌能力也就會下降。同時，涂布液黏度越大，在涂布過程中不易于涂布液的流動，容易造成涂布不均勻，制成的涂布抗菌紙表面特別光滑且很脆，也就降低了產(chǎn)品的機械強度。殼聚糖的抗菌機制與分子質(zhì)量有密切關(guān)系，有研究者認(rèn)為［23］，高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的殼聚糖通過不同的機制發(fā)揮抗菌作用。高分子質(zhì)量殼聚糖在細菌細胞表面堆積，阻斷代謝可能為其主要抗菌機制。隨著分子質(zhì)量的增大，殼聚糖分子有效基因被包埋，對菌體的吸附及抗菌能力大大降低。而低分子質(zhì)量殼聚糖分子，可以通過滲透作用穿過多孔細胞壁進入細菌內(nèi)部，破壞細胞質(zhì)中內(nèi)含物的膠體狀態(tài)，使細菌無法進行正常的生理活動，或者直接干擾其帶負電荷的遺傳物質(zhì)DNA和RNA，抑制細菌的繁殖，導(dǎo)致微生物的死亡。

2.6 涂布量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張強度的影響

在研究涂布量對紙張性能的影響時，涂布液中殼聚糖的濃度為15 g/L，淀粉與殼聚糖的濃度之比為1.5∶1.0，乙酸用量為 1.5%，pH 值為 5，殼聚糖的相對分子質(zhì)量為20萬，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 涂布量對涂布抗菌紙抗菌性能及抗張指數(shù)的影響

由圖6可以看出，當(dāng)涂布量由0.96 g/m2增加到2.02 g/m2時，抑菌圈直徑增加，其后隨著涂布量的增大，抑菌圈直徑減小。涂布抗菌紙的抗張指數(shù)隨著涂布量的增大而增大，但當(dāng)涂布量由3.08 g/m2增加到5.20 g/m2時，抗張指數(shù)增加不明顯。綜合考慮涂布量對紙張抗菌性能和抗張強度的影響，以及生產(chǎn)成本，適宜涂布量為2.02 g/m2。

3 結(jié)論

通過實驗發(fā)現(xiàn)，涂布液中殼聚糖的濃度、淀粉與殼聚糖的濃度之比、殼聚糖的相對分子質(zhì)量、乙酸用量、pH值及涂布量等條件不同時，制備的涂布抗菌紙的抗菌性能和抗張強度有較大不同，并得到了實驗條件下殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙制備的適宜條件為:涂布液中殼聚糖濃度15 g/L、淀粉與殼聚糖的濃度之比1.5∶1.0、pH 值5、乙酸用量1.5%、殼聚糖相對分子質(zhì)量20萬、涂布量2.02 g/m2，此時獲得的殼聚糖-淀粉涂布抗菌紙具有較好的強度和抗菌性能。

［1］ZHAO Yu-qing，BU Jin-feng，HAI Hua，et al.Studies on the bacteriostasis of CTS-compounds［J］.Progress In Biotechnology，2005，25(5):67.

趙玉清，部金鳳，海 華，等.殼聚糖的抑菌性研究［J］.中國生物工程雜志，2005，25(5):67.

［2］Sun S L，Wang A Q.Adsorption properties and mechanism of crosslinked carboxymethyl-chitosan resin with Zn(Ⅱ)as template ion［J］.Reactive＆ Functional Polymers，2006，66(8):819.

［3］Hiroki A，Tran H T，Nagasawa N，et al.Metal adsorption of carboxymethyl cellulose/carboxymethyl chitosan blend hydrogels prepared by Gamma irradiation［J］.Radiation Physics and Chemistry，2009，78(12):1076.

［4］YE Lei，HE li-qian，GAO Tian-zhou，et al.Studies on the antibiotic activity and its stability of chitosan［J］.Journal of Beijing Union University:Natural Sciences，2004，18(1):9.

葉 磊，何立千，高天洲，等.殼聚糖的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究［J］.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，18(1):79.

［5］Chung Y C，Chen C Y.Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan［J］. Bioresource Technology， 2008，99(8):2806.

［6］Kong M，Chen X G，Liu C S，et al.Antibacterial mechanism of chitosan microspheres in a solid dispersing system againstE.coli［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2008，65(2):197.

［7］Coma V，Deschamps A，Gros A M.Bioactive packaging materials from edible chitosan polymer antimicrobial activity assessment on dairy related contaminants［J］.Journal of Food Science，2003，68(9):2788.

［8］Issams T，Adelem G，Adele P，et al.Chitosan polymer as bioactive coating and film against Aspergillus niger contamination［J］.Journal of Food Science，2005，70(2):100.

［9］Coma V，Deschamps A，Gros M.Bioactive packaging materials from edible chitosan polymer antimicrobial activity assessment on dairy related contaminants［J］. JournalofFood Science，2003，68(9):2788.

［10］WAN Rong-xin，GU Han-qing.The Research on antibacterial properties of chitosan and its derivatives［J］.Chinese Journal of Dialysis and Artificial Organs，2010，21(2):36.

萬榮欣，顧漢卿.殼聚糖及其衍生物抗菌性能的研究進展［J］.透析與人工器官，2010，21(2):36.

［11］Jeon Y J，Park P J，Kim S K.Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor［J］.Carbohydrate Polymers，2001，44(1):71.

［12］Hong K N，Park N Y，Lee S H，et al.Antibacterial activity of chitosan and chitosan oligomers with different molecular weight［J］.International Journal of Food Microbiology，2002，74(1/2):65.

［13］DUAN Wei-jiang，CHA Rui-tao，PAN Quan-li，et al.Application of Cationic Chitosan in Cigarette Paper Manufacture［J］.China Pulp＆ Paper，2010，29(8):25.

段韋江，查瑞濤，潘泉利，等.陽離子殼聚糖在卷煙紙抄造中的應(yīng)用研究［J］.中國造紙，2010，29(8):25.

［14］HU Hui-ren，WEN Yang-bing，SHI Shu-lan，et al.Application of Chitosan/bentonite Particle Retention and Drainage System in Tobacco Sheet Manufacture by Papermaking Process［J］.China Pulp ＆Paper，2011，30(4):30.

胡惠仁，溫洋兵，石淑蘭，等.殼聚糖/膨潤土微粒助留助濾體系在造紙法煙草薄片生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［J］.中國造紙，2011，30(4):30.

［15］MA Yong-sheng，QIU Hua-yu，WANG Jian-bo，et al.Preparation and Application of Chitosan-AM-DMDAAC Graft Copolymer［J］.China Pulp ＆ Paper，2008，27(2):29.

馬永生，邱化玉，王建波，等.殼聚糖-AM-DMC三元接枝共聚物對紙漿的增強效果［J］.中國造紙，2008，27(2):29.

［16］YANG Qiang，LIU Zhong.Preparation and Applications of Graft Copolymer of Chitosan with Polyacrylamide(CAM)［J］.China Pulp＆ Paper，2003，22(12):15.

楊 強，劉 忠.殼聚糖丙烯酰胺接技共聚物的合成及應(yīng)用［J］.中國造紙，2003，22(12):15.

［17］LIU Yong-sun，WANG Bao，ZUANG Yao-li，et al.Application of modified chitosan as a surface sizing agent in the light offset paper［J］.Paper Chemicals，2009，21(1):40.

劉永順，王 保，莊耀禮，等.改性殼聚糖類表面施膠劑在輕型膠版紙中的應(yīng)用［J］.造紙化學(xué)品，2009，21(1):40.

［18］Cui Wen-yan，Liu Zhong.Chitosan as a Surface Sizing Agent for Offset Printing Paper ［J］.World Pulp and Paper，2005，24(4):11.

崔文妍，劉 忠.殼聚糖作為表面施膠劑在膠版印刷紙中的應(yīng)用［J］.國際造紙，2005，24(4):11.

［19］WANG Yue-hui，YU Xiong-wei，XU Yuan-yang，et al.Antibacterial action sites of chitosans［J］.Food Science，2012，33(13):92.王月慧，余雄偉，徐遠陽，等.殼聚糖抑菌作用位點的研究［J］.食品科學(xué)，2012，33(13):92.

［20］WU Guo-jie，YAO Ru-hua.Studies on rheological properties of chitosan solution［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science，1997，25(10):62.

吳國杰，姚汝華.殼聚糖溶液流變學(xué)性質(zhì)的研究［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1997，25(10):62.

［21］HAN Yong-sheng，ZHAO Li-mei.Study of packaging performance of modified starch-chitosan edible Film［J］.Packaging Engineering，2009，30(12):34.

韓永生，趙麗美.變性淀粉殼聚糖可食性膜包裝性能研究［J］.包裝工程，2009，30(12):34.

［22］LI De-peng，TAN Ji-ye，DING Shi-qiang，et al.Study on Properties of Chitosan Solution［J］.Journal of Dalian University，2002，23(6):5.

李德鵬，譚績業(yè)，丁仕強，等.殼聚糖溶液性質(zhì)的研究［J］.大連大學(xué)學(xué)報，2002，23(6):5.

［23］FENG Shou-ai，LIN Bao-feng，Liang Xing-quan.Research Development of Chitosan Film in Food Preservation［J］.Polymer Bulletin，2004，12(6):68.

馮守愛，林寶鳳，梁興泉.殼聚糖保鮮膜的研究進展［J］.高分子通報，2004，12(6):68.

［24］LIU Yang，YU Jing-tao，SUN Ying-ying.Research on antibacterial action of chitosan and chitosan derivatives［J］.Chinese Journal of Practical Stomatology，2011，4(7):437.

劉 揚，于靜濤，孫瑩瑩，等.殼聚糖及其衍生物抗菌性能研究進展［J］.中國實用口腔科雜志，2011，4(7):437. CPP