段維軍, 張慧麗, 郭立新, 顧建鋒, 陳先鋒, 張祥林, 夏侯陽(yáng)
(1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局,寧波 315012;2.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊 830063;3.寧波大學(xué),寧波 315212)
植物病原性輪枝菌主要包括:黑白輪枝菌[Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold(1879)]、大麗輪枝 菌 [V.dahliae Klebahn (1913)]、三 體 輪 枝 菌[V.tricorpus Isaac(1953)]、變黑輪枝菌[V.nigrescens Pethybridge(1919)]、云狀輪枝菌[V.nubilum Pethybridge (1919)]、V.the obromae (Turconi)Mason et Hughes(1951)[1]以 及 長(zhǎng) 孢 輪 枝 孢 [V.longisporum(Stark)Karapapa,Bainbr & Heale(1997)],也被稱為大麗輪枝菌長(zhǎng)孢變種[V.dahliae var.long is porum Stark(1961)][2]。它們多能引起植物維管束病害,造成植物葉片黃化、落葉等癥狀,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植物死亡。這些輪枝菌可產(chǎn)生多種休眠形態(tài),如微菌核、厚垣孢子或休眠菌絲等,長(zhǎng)時(shí)間在土壤中存活。由于其嚴(yán)重危害性,其中的一些種類,如大麗輪枝菌和黑白輪枝菌已經(jīng)被列為我國(guó)重要植物檢疫對(duì)象。這些輪枝菌均能夠產(chǎn)生典型的輪枝狀分生孢子梗,形態(tài)十分接近,單純依靠形態(tài)學(xué)特征很難加以準(zhǔn)確快速區(qū)分。
DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA片段對(duì)地球上現(xiàn)有物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)[3]。自加拿大生物學(xué)家Hebert首先倡導(dǎo)將條形碼編碼技術(shù)應(yīng)用到比零售業(yè)更復(fù)雜的生物物種鑒定之后[4-5],發(fā)展十分迅猛,是近年來(lái)進(jìn)展最迅速的學(xué)科前沿之一,在動(dòng)物、植物等多種生物上得到了廣泛重視。真菌的核糖體RNA基因簇同時(shí)存在于細(xì)胞核內(nèi)與線粒體中,由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成,以其為代表的ITS基因標(biāo)記已被廣泛用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、預(yù)測(cè)種群結(jié)構(gòu)、評(píng)估種群進(jìn)化過(guò)程,生態(tài)學(xué)研究以及確定物種分類地位等[6-11],同時(shí)也被考慮作為DNA條形碼。但是,由于一些真菌類群平均ITS片段小于有效進(jìn)行DNA編碼的最優(yōu)片段臨界值[12],同時(shí)對(duì)于物種相對(duì)豐富的子囊菌類群來(lái)說(shuō) ITS區(qū)段還存在變異性不足,難以有效區(qū)分不同種類的缺點(diǎn)。因此,在適于作真菌DNA條形碼的基因區(qū)段的選擇上,還需做更多研究和評(píng)估工作。
本研究選擇ITS片段作為輪枝菌的候選DNA條形碼,對(duì)候選ITS片段的PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率、種內(nèi)與種間差異、種內(nèi)與種間距離的頻率分布進(jìn)行系統(tǒng)篩選和評(píng)價(jià),以此來(lái)評(píng)估ITS片段作為輪枝菌條形碼的可行性。
1.1.1 供試菌株的分離、收集與純化
采用常規(guī)的組織塊PDA平板分離法及菌種收集工作,共得到植物病原性輪枝菌35株,分屬于13個(gè)種,進(jìn)行單孢分離后得到單孢分離株,保存在PDA試管斜面(4℃),備用。分離株編號(hào)、地理分布、寄主及來(lái)源見(jiàn)表1。
表1 供試輪枝菌屬分離株Table 1 Isolates of Verticilliumspp.used in this study
續(xù)表1 Table1(Continued)
1.1.2 培養(yǎng)基
采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基進(jìn)行分離、純化、菌絲收集和保藏。
1.1.3 儀器和試劑
培養(yǎng)箱為德國(guó)MMM公司生產(chǎn)的Friocell 222型,核酸自動(dòng)化提取儀為美國(guó)ThermoFisher公司生產(chǎn)的Kingfisher型,PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的TProfessional Basic型,生物分光光度計(jì)為日本日立公司生產(chǎn)的U-0080D型,電泳設(shè)備和凝膠成像系統(tǒng)分別為伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的Power-Pac Basic型和GelDocEQ型;核酸提取試劑盒為臺(tái)灣奈米技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的TANBead Plant DNA Auto Kit型、Taq DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR buffer、DL2000Marker、DNA片段純化試劑盒均購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司;試驗(yàn)用引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成;其他試劑均為分析純。
1.2.1 基因組DNA提取
用滅菌槍頭刮取在PDA平板上培養(yǎng)20d左右菌株菌絲體,根據(jù)試劑盒及儀器使用說(shuō)明,在核酸自動(dòng)化提取儀上使用核酸提取試劑盒(臺(tái)灣奈米技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)進(jìn)行DNA提取。提取后DNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度后,凍存于-20℃冰箱備用。
1.2.2 基因的擴(kuò)增和測(cè)序
采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增[16]。PCR擴(kuò)增在TProfessional Basic PCR儀上進(jìn)行,使用50μL體系。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳儀在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè),確認(rèn)擴(kuò)增成功后,使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,并用DNA片段純化試劑盒根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。
1.2.3 ITS片段用于輪枝菌屬DNA條形碼的評(píng)價(jià)
1.2.3.1 獲得ITS片段的難易程度
不同基因序列獲得的難易程度用PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率表示,高質(zhì)量的測(cè)序圖譜,底峰較小,無(wú)雜峰、亂峰視為成功測(cè)序。PCR擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率的乘積為PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率。
1.2.3.2 ITS
利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)Λ@得的不同序列片段進(jìn)行比對(duì)分析,確認(rèn)序列的可靠性。將測(cè)得的序列與GenBank中下載的其他輪枝菌相關(guān)序列用CLUSTAL X[17]程序進(jìn)行分析,如果序列長(zhǎng)度不同,則只保留共有區(qū)段。將比對(duì)好的序列輸入DNAstar軟件(Lasergene,WI,USA)計(jì)算相似性矩陣,然后用Taxon-Gap軟件[18]分析各基因在種內(nèi)與種間的變異情況。
1.2.3.3 種內(nèi)與種間距離頻率分布
應(yīng)用Species identifier軟件[19]比較種內(nèi)及種間的遺傳距離差異,并用EXCEL軟件作圖分析。使用Species identifier的Best Match功能進(jìn)行條形碼種類鑒定成功率的計(jì)算。
1.2.3.4 鄰接樹(shù)構(gòu)建
使用 MEGA5.0程序[20]進(jìn)行比對(duì),以 NCBI上下載的大豆疫霉(Phytophthora sojae)的ITS序列(HQ643349)為外群,按照Saitou and Nei[21]的方法采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù),進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣計(jì)算系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的置信度。
評(píng)價(jià)DNA條形碼的一個(gè)重要指標(biāo)是序列獲得的難易程度,即PCR擴(kuò)增與測(cè)序的成功率。本研究成功獲得輪枝菌屬13個(gè)種35個(gè)菌株的ITS片段,片段長(zhǎng)度約為550bp左右,PCR擴(kuò)增與測(cè)序成功率為97.1%。
本試驗(yàn)獲得的輪枝菌屬13個(gè)種35個(gè)ITS片段的序列,與GenBank下載的相關(guān)輪枝菌屬I(mǎi)TS序列共73條序列一起進(jìn)行分析,以探討ITS片段區(qū)分不同輪枝菌種類的能力。輪枝菌屬I(mǎi)TS片段的種內(nèi)與種間序列差異分析如圖1所示,圖中黑色柱表示種間差異,白色柱表示種內(nèi)差異。結(jié)果表明,供試輪枝菌屬不同種類中V.chlamydosporium、V.fungicola、V.griseum、V.lecanii、V.lindauianum、V.nigrescens、V.nubilum、V.psalliotae、V.theobromae和V.tricorpus的種間差異均大于種內(nèi)差異,占到了供 試 種 類 的 76.9% (10/13),但 V.albo-atrum、V.dahliae和V.longisporum的種內(nèi)差異大于種間差異。
圖1 采用TaxonGap軟件分析輪枝菌屬I(mǎi)TS片段種內(nèi)與種間差異Fig.1 Comparisons of intra-and inter-specific variations of ITS fragment fromVerticilliumspp.
應(yīng)用 Taxon DNA/Species identifier軟件Pairwise Summary功能對(duì)所獲得的各物種ITS序列進(jìn)行分析,ITS條形碼片段的種內(nèi)與種間距離的頻率分布如圖2所示。種內(nèi)距離(intraspecific distance)主要集中在0~5.0%間,而種間距離(interspecific distance)則在5%~40%之間,兩者存在交叉重疊,其中≤0的差異序列占42.6%。使用Species identifier的Best Match分析功能,能夠進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的序列占到了供試序列的94.5%(69/73)。
圖2 輪枝菌屬I(mǎi)TS序列種內(nèi)與種間差距的頻率分布Fig.2 Intraspecific and interspecific distances of ITS in Verticillium species
輪枝菌屬I(mǎi)TS基因構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示,同一個(gè)種的菌株聚在一起,不同的種則位于不同的末端分支,但是V.albo-atrum 和V.longisporum 不能很好分辨開(kāi)(圖3),這與ITS基因種內(nèi)與種間差異分析結(jié)果相一致。植物病原性輪枝菌,包括黑白輪枝菌、大麗輪枝菌、三體輪枝菌、變黑輪枝菌、云狀輪枝菌、V.the obromae和長(zhǎng)孢輪枝菌聚在了一起,形成了一個(gè)大的分支(bootstrap值為99)。其中的黑白輪枝菌、大麗輪枝菌、長(zhǎng)孢輪枝菌、三體輪枝菌和云狀輪枝菌具有更加緊密的親緣關(guān)系(bootstrap值為99)。非植物病原性輪枝菌聚為了另一個(gè)大的分支(bootstrap值為93)。
輪枝菌屬真菌均可產(chǎn)生典型輪枝狀分生孢子梗,且存在較大的形態(tài)變異,一些賴以區(qū)分的典型形態(tài)結(jié)構(gòu),如黑白輪枝菌的休眠菌絲,大麗輪枝菌的微菌核在培養(yǎng)中均有可能喪失,因此單純依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行輪枝菌種類區(qū)分具有較高難度。與傳統(tǒng)分類學(xué)方法比較,DNA條形碼的優(yōu)勢(shì)在于:(1)同一物種在其個(gè)體發(fā)育的各階段均能作為分析對(duì)象,增加了待檢樣本的采集渠道;(2)待檢對(duì)象不受其個(gè)體形態(tài)特征或組織特異性限制,樣品形態(tài)發(fā)生改變或者殘缺均不會(huì)影響識(shí)別結(jié)果;(3)識(shí)別速度快且準(zhǔn)確性高,克服因形態(tài)相似所導(dǎo)致的鑒定誤差,加速新物種的發(fā)現(xiàn);(4)可操作性強(qiáng),不需要專門(mén)的分類學(xué)知識(shí)也可以完成物種的鑒定,節(jié)省人力和物力[22]。為了實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快捷而準(zhǔn)確的物種鑒定,DNA條形碼必須容易獲得,這是衡量DNA條形碼技術(shù)的最基本標(biāo)準(zhǔn)之一[23]。本研究表明,供試輪枝菌屬I(mǎi)TS片段很容易直接擴(kuò)增和測(cè)序,引物通用性強(qiáng),擴(kuò)增測(cè)序成功率高達(dá)97.1%,具有合適的片段長(zhǎng)度(550bp左右),便于高通量測(cè)序與分析。同時(shí),Genbank等DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中也已經(jīng)積累了大量真菌ITS序列,便于參照和比較分析。理想條形碼檢測(cè)到的同屬內(nèi)種間遺傳變異應(yīng)明顯大于種內(nèi)遺傳變異,并在兩者之間存在顯著差異,形成一個(gè)明顯的間隔區(qū),它是評(píng)價(jià)DNA條形碼理想與否的另一個(gè)重要指標(biāo)[24-25]。本研究中,供試13個(gè)種中有10個(gè)種的種間差異大于種內(nèi)差異,存在交叉重疊,除無(wú)法成功區(qū)分親緣關(guān)系很近的種外,其序列鑒定成功率達(dá)94.5%。
圖3 根據(jù)輪枝菌ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the neighbor-joining(NJ)analysis inferred from the ITS regions of Verticilliumspp.
近來(lái)研究表明,黑白輪枝菌和長(zhǎng)孢輪枝菌目前在種類劃分上仍然存在較大爭(zhēng)議。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn),來(lái)自于不同寄主和地理來(lái)源的黑白輪枝菌能夠被劃分為3個(gè)不同分支[26]。最近,Inderbitzin等已將黑白輪枝菌重新劃分為3個(gè)新種[27]。有研究表明長(zhǎng)孢輪枝孢可能是輪枝菌種間雜交所致,可能的親本來(lái)自于大麗輪枝菌、黑白輪枝菌或其他輪枝菌,其分生孢子中DNA含量接近大麗輪枝菌的1.75倍,由其所產(chǎn)生分生孢子長(zhǎng)度可達(dá)7~9μm,微菌核較大麗輪枝菌更加細(xì)長(zhǎng)[2,28]。Karapapa等認(rèn)為應(yīng)將歐洲油菜上分離的大麗輪枝菌長(zhǎng)孢變種上升到新種高度,即V.longisporum[28]。然而,也有一些與此不一致的報(bào)道。如來(lái)自于英國(guó)球芽甘藍(lán)(Brussels sprouts)的一株分離物具有較高的DNA含量,但是分生孢子卻較短[28]。分離物V33具有較長(zhǎng)分生孢子,但是DNA含量卻比較低[29]。本研究中ITS片段對(duì)黑白輪枝菌和長(zhǎng)孢輪枝菌劃分存在一定問(wèn)題可能與這些種類分類地位不穩(wěn)定存在一定關(guān)系,因此在對(duì)生物物種進(jìn)行DNA條形碼研究時(shí),應(yīng)該選擇經(jīng)過(guò)可靠形態(tài)鑒定且不存在分類爭(zhēng)議的物種為材料,然后測(cè)定其標(biāo)記基因的序列,以實(shí)現(xiàn)對(duì)該物種的有效DNA條形編碼。
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