葛平華， 馬桂珍， 付泓潤(rùn)， 暴增海， 王淑芳， 劉兆普

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，連云港 222005）

油菜菌核?。╮ape sclertiniose）是由子囊菌亞門(mén)真菌核盤(pán)菌［Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Ba－ry］引起的世界性病害，是油菜生產(chǎn)中的重要病害之一，一般年份發(fā)病率高達(dá)10%～30%，嚴(yán)重的年份達(dá)80%以上［1－3］，因此油菜菌核病的防治一直受到重視。目前油菜菌核病的防治主要依靠化學(xué)防治，但化學(xué)防治導(dǎo)致環(huán)境污染以及菌株抗藥性形成等問(wèn)題，限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用。而生物防治可彌補(bǔ)化學(xué)防治的不足，日益受到人們的重視，多種有益微生物用于油菜菌核病的防治，取得了顯著的防治效果［4－6］。郭春燕等篩選得到一株海洋細(xì)菌Bacillus velezensis DM09，在離體試驗(yàn)中該菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病的防效達(dá)92.51%［7］。李國(guó)慶、姜道宏等深入研究了盾殼霉對(duì)油菜菌核病的防治作用，研究表明盾殼霉分生孢子能夠在油菜花瓣上定殖［8］，并且盾殼霉可直接與復(fù)合肥混合使用，對(duì)油菜菌核病有明顯的抑制作用［9］。本試驗(yàn)從連云港海域海水中篩選得到1株對(duì)油菜菌核病菌拮抗作用較強(qiáng)的海洋細(xì)菌GM－1菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行了種類(lèi)鑒定和抗菌作用研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）由本研究室保存并提供；GM－1菌株由本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域海水中分離獲得。

1.2 盆栽用土與供試種子

取油菜田土，滅菌備用。供試油菜種子由種子公司購(gòu)買(mǎi)。

1.3 培養(yǎng)基

油菜菌核病菌培養(yǎng)和抑菌試驗(yàn)用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；海洋細(xì)菌GM－1菌株培養(yǎng)用2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5g、酵母粉1g、瓊脂15～20g、陳海水1000mL。油菜菌核病菌固體菌種培養(yǎng)基：麥麩與等量的PD培養(yǎng)液（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL）混勻。

1.4 GM－1菌株的種類(lèi)鑒定

1.4.1 GM－1菌株形態(tài)特征觀察

將菌株GM－1接種于LB培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察記錄菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色、芽胞染色、鞭毛染色。

1.4.2 生理生化試驗(yàn)

生理生化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［10］的方法，主要測(cè)定吲哚試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、半固體瓊脂穿刺試驗(yàn)、好氧性和明膠液化等生理生化指標(biāo)。

1.4.3 16SrDNA序列的擴(kuò)增分析

GM－1菌株基因組DNA的提取參考Kingston等［11］的方法。

采用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）［12］。PCR 擴(kuò) 增條件為94℃預(yù)變性4min；94℃變性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。采用1.0%瓊脂糖對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序獲得GM－1菌株16SrDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA5軟件包 Neighbour－joining（bootstrap1000）法進(jìn)行序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.4 gyrB基因序列的擴(kuò)增分析

采 用 通 用 引 物 UP－1（5′－GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGGNGGNAARTTYGA－3′）和 UP－2 （5′－AGCAGGCTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCKTCNGTCAT －3′）［13］進(jìn)行g(shù)yrB基因序列擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min，94℃1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min［14］。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌gyrB序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA5軟件包 Neighbour－joining（bootstrap1000）法進(jìn)行序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 GM－1菌株對(duì)油菜菌核病菌的抑制作用

1.5.1 GM－1菌株對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)的影響

選取大小基本一致的菌核，用0.1%升汞溶液（W／V）浸泡菌核1min、75%乙醇溶液（V／V）浸泡菌核3～4min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水浸洗3～4次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。將表面消毒的菌核在GM－1菌株菌液和無(wú)菌發(fā)酵液中浸泡24h，擺放在PDA平板上，每平板5粒菌核，共20個(gè)平板。28℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌核萌發(fā)情況，計(jì)算菌核萌發(fā)的抑制率。以無(wú)菌水處理為對(duì)照。

1.5.2 GM－1菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

GM－1菌株對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用采用平板對(duì)峙法［15］。在PDA培養(yǎng)基平板中央接種直徑為8mm油菜菌核病菌菌苔，在菌苔周?chē)嚯x培養(yǎng)皿邊緣1.5cm處劃線接種GM－1菌株，于28℃倒置恒溫培養(yǎng)，重復(fù)3次。5d后觀察油菜菌核病菌菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌帶寬度；挑取抑菌圈交界處的菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲細(xì)胞形態(tài)，以正常菌絲為對(duì)照。

菌株GM－1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用采用牛津杯法［16］。將油菜菌核病菌菌苔（8mm）接種在PDA平板中央，菌苔周?chē)鷮?duì)稱(chēng)放置牛津杯，牛津杯中加入無(wú)菌發(fā)酵液200μL，重復(fù)3次。28℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，測(cè)定抑菌帶寬度，并挑取抑菌圈交界處菌絲，于顯微鏡下觀察菌絲細(xì)胞形態(tài)，以正常菌絲為對(duì)照。

1.6 GM－1菌株促生及防治油菜菌核病的盆栽試驗(yàn)

1.6.1 種子催芽試驗(yàn)

將飽滿(mǎn)的油菜種子在GM－1菌株發(fā)酵液中浸泡4h，取出后擺放于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30粒，重復(fù)3次，以無(wú)菌水和培養(yǎng)液分別為對(duì)照CK1和CK2，28℃恒溫培養(yǎng)72h，檢查油菜種子的發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率，測(cè)量發(fā)芽種子的根長(zhǎng)。

1.6.2 盆栽防病試驗(yàn)

采用灌根法［17］。將油菜菌核病菌的固體培養(yǎng)物按照每盆15g接入到裝有無(wú)菌土的花盆中，室溫放置4d。用GM－1菌株發(fā)酵液（100mL／盆）浸濕土壤后每盆播種10粒油菜種子，以無(wú)菌水浸濕土壤為對(duì)照CK1、培養(yǎng)液浸濕土壤為對(duì)照CK2，每處理10盆。播種15d后記錄各處理發(fā)病株數(shù)、測(cè)量株高及苗株干重。并按以下公式計(jì)算發(fā)病率和防治效果：

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋細(xì)菌GM－1菌株的種類(lèi)鑒定

2.1.1 海洋細(xì)菌GM－1菌株的形態(tài)特征

GM－1菌株在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，菌落呈圓形、隆起、乳黃色、不透明、邊緣不整齊、表面濕潤(rùn)不光滑、生長(zhǎng)后期菌落顏色變深。細(xì)胞呈桿狀，G＋，單個(gè)排列也有鏈狀排列（圖1a），有芽胞、中生（圖1b），極生單鞭毛（圖1c），無(wú)莢膜（圖1d）。

圖1 細(xì)菌GM－1細(xì)胞形態(tài)（10×100）Fig.1 Cell morphology of the strain GM－1（10×100）

2.1.2 海洋細(xì)菌GM－1菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株GM－1可利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、木糖醇等糖醇進(jìn)行發(fā)酵，不能利用木糖、阿拉伯糖、肌醇；并且吲哚試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、丙二酸鹽呈陽(yáng)性，42℃可生長(zhǎng)，好氧且具有運(yùn)動(dòng)性；在大分子試驗(yàn)中，菌株GM－1的石蕊牛奶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和淀粉水解試驗(yàn)均顯陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌GM－1菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of the antagonistic strain GM－1

通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察和一系列的生理生化試驗(yàn)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［18］發(fā)現(xiàn) GM－1菌株符合芽胞桿菌的特性，屬于芽胞桿菌屬（Bacillus）。

2.1.3 GM－1菌株16SrDNA序列分析

GM－1菌株16SrDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序得到大小為1455bp的片段。將該序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，GM－1菌株與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）的相似性均達(dá)98%以上。選取GenBank中相似性較高的模式菌株序列，采用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，GM－1菌株與芽胞桿菌屬中B.amyloliquefaciens在同一分支，菌株GM－1可能屬于芽胞桿菌屬的B.amyloliquefaciens，結(jié)果見(jiàn)圖2。在現(xiàn)代微生物分類(lèi)學(xué)上，16SrDNA序列已廣泛地應(yīng)用于研究細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。然而，在芽胞桿菌屬枯草芽胞桿菌組中，不同菌株的16SrDNA序列相似性都超過(guò)了97%。因此，單純依據(jù)16SrDNA序列并不能將菌株GM－1準(zhǔn)確鑒定到種的水平。

2.1.4 GM－1菌株gyrB基因序列分析

gyrB基因是編碼DNA促旋酶B亞基的基因。作為一種新的分子標(biāo)記，該基因序列有比16SrDNA高得多的堿基替換頻率，并且在細(xì)菌中普遍存在其近乎呈單拷貝形式，目前在細(xì)菌種級(jí)水平的鑒定方面具有較強(qiáng)的可行性［19－20］。

GM－1菌株gyrB基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到大小為1213bp的片段。BLAST結(jié)果表明，GM－1菌株與B.amyloliquefacien的相似度最高，為99%。采用MEGA5軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，GM－1菌株和B.amyloliquefaciens位于同一分支上，這一結(jié)果與基于16SrDNA序列分析的結(jié)果一致，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子證據(jù)，菌株GM－1應(yīng)該屬于B.amyloliquefaciens。

圖2 GM－1菌株16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence of GM－1

圖3 GM－1菌株gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrBsequence of GM－1

2.2 GM－1菌株和發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌的抑制作用

2.2.1 GM－1菌株和發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)的抑制作用

表2、圖4顯示，原發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌核的萌發(fā)有明顯的抑制作用，培養(yǎng)1d抑制率都達(dá)到100%，3d抑制率分別為100%和90%，5d抑制率分別為100%和4%。結(jié)果表明，菌液對(duì)菌核的萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用，而無(wú)菌發(fā)酵液隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用逐漸減弱。

2.2.2 GM－1菌株對(duì)油菜菌核病菌菌絲的抑制作用

GM－1菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌絲的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，培養(yǎng)7d的抑菌帶寬度分別達(dá)到30mm和16mm，見(jiàn)圖5。

表2 GM－1菌株和發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the strain GM－1and sterile fermentation broth on sclerotia germination of S.sclerotiorum

圖4 GM－1菌株對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of the strain GM－1on sclerotia germination of S.sclerotiorum

圖5 GM－1菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the strain GM－1and sterile fermentation broth on mycelium growth of S.sclerotiorum

圖6顯示GM－1菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)菌絲結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用，導(dǎo)致菌絲細(xì)胞壁變厚、膨大，細(xì)胞空洞、原生質(zhì)分布不均勻。

2.3 GM－1菌株促生及防治油菜菌核病的盆栽試驗(yàn)

2.3.1 種子催芽試驗(yàn)

經(jīng)GM－1菌株發(fā)酵液處理后油菜種子發(fā)芽率為98.9%，高于無(wú)菌水和培養(yǎng)液對(duì)照處理的93.3%和91.1%，且差異均達(dá)到顯著水平（表3）。

圖6 菌株GM－1對(duì)油菜菌核病菌菌絲細(xì)胞的抑制作用顯微觀察結(jié)果（10×20）Fig.6 Inhibitory effects of the strain GM－1on mycelium growth of S.sclerotiorum （10×20）

表3 GM－1菌株發(fā)酵液對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響1）Table 3 Effects of the sterile fermentation broth of the strain GM－1on germination of rape seeds

處理后的油菜種子發(fā)芽后的平均根長(zhǎng)為14.01mm，顯著高于對(duì)照。試驗(yàn)中觀察到，處理的種子根部比對(duì)照明顯粗壯，且根尖無(wú)黃化現(xiàn)象，說(shuō)明GM－1菌株對(duì)油菜種子的萌發(fā)生長(zhǎng)有一定的促生作用。

2.3.2 盆栽防病試驗(yàn)

采用灌根法進(jìn)行盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，GM－1菌株對(duì)油菜植株生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的促生作用。經(jīng)該菌發(fā)酵液處理后油菜幼苗株高為6.44cm，顯著高于無(wú)菌水和培養(yǎng)液處理的對(duì)照；處理的發(fā)病率明顯低于對(duì)照，發(fā)酵液的防病效果達(dá)到68.0%（表4）。

表4 盆栽防病試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The control effects of the strain GM－1 on S.sclerotiorumby pot tests

試驗(yàn)中無(wú)菌水處理的CK1的發(fā)病率為52.6%，明顯低于用培養(yǎng)液處理的CK2，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于培養(yǎng)液利于油菜菌核病菌的生長(zhǎng)和侵染，因而CK2的發(fā)病率較高。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)及16SrDNA序列、gyrB基因序列分析，將GM－1菌株鑒定為芽胞桿菌屬的解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。

近年來(lái)Biolog、16SrDNA的序列分析等方法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定［21］，對(duì)多數(shù)細(xì)菌的鑒定發(fā)揮著重要作用，但對(duì)于相近種類(lèi)難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，如解淀粉芽胞桿菌與死谷芽胞桿菌［22］以及枯草芽胞桿菌［23－24］等。

gyrB基因的分子進(jìn)化速率大于16SrDNA基因，因而更適合細(xì)菌近緣種的準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定，Wang［25］等對(duì)8個(gè)枯草芽胞桿菌組的個(gè)體進(jìn)行聚類(lèi)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用16SrDNA作為靶標(biāo)分子時(shí)，只能將其分為兩個(gè)亞群，亞群內(nèi)16SrDNA的相似度多在98%以上，而gyrB基因序列在亞群中的相似度為75.2%～99.2%，表明gyrB基因可應(yīng)用于細(xì)菌近緣種之間的鑒別［26］。La等在比較4種不同種屬的芽胞桿菌時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比基于16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)更能有效地將他們分開(kāi)［27］。

抑菌作用測(cè)定結(jié)果表明：GM－1菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病菌菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用，細(xì)胞壁變厚、膨大，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)分布不均勻，明顯抑制菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)7d的抑菌帶寬度分別達(dá)到30mm和16mm，并對(duì)菌核的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，菌液的抑制明顯高于無(wú)菌發(fā)酵液，其5d的抑制率達(dá)100%，無(wú)菌發(fā)酵液3d的抑制率為90%，但到5d時(shí)抑制率僅為4%。這可能是由于GM－1菌株的代謝產(chǎn)物可以推遲菌核的萌發(fā)時(shí)間，而不能導(dǎo)致菌核的死亡。

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，GM－1菌株發(fā)酵液對(duì)油菜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，對(duì)油菜菌核病具有較好的防治效果，表現(xiàn)出良好的生防前景。

有關(guān)海洋解淀粉芽胞桿菌對(duì)油菜菌核病的抑制作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果為解淀粉芽胞桿菌用于油菜菌核病的生物防治提供了理論依據(jù)，今后將開(kāi)展GM－1菌株抗菌作用機(jī)制、發(fā)酵條件優(yōu)化以及抗菌作用的田間試驗(yàn)研究。

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