李麗娟,張德生,莊朋偉,張艷軍,張密霞

(天津中醫(yī)藥大學,天津 300193)

近期研究[1]表明,不同人群粒細胞對腫瘤細胞的殺傷能力不同,而且隨著年齡增加,粒細胞活力逐漸下降,腫瘤患者的粒細胞表現(xiàn)為極弱的腫瘤細胞殺傷能力。崔正等[2]報道,腫瘤自然消退/完全消退(SR/CR)小鼠的粒細胞能抵抗多種類型的癌細胞,使腫瘤產(chǎn)生自發(fā)消退和/或其中性粒細胞體外能在腫瘤細胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu),并殺死瘤細胞/移植SR/CR 小鼠粒細胞至普通小鼠,普通小鼠可獲得抗腫瘤能力。當機體發(fā)生細菌感染時白細胞可被激活,而細菌細胞壁脂多糖是激活白細胞的主要物質(zhì),真菌多糖可提高機體的細胞免疫及體液免疫水平[3],故推測某些真菌類多糖可能能通過提高粒細胞殺傷腫瘤細胞的能力從而發(fā)揮防治腫瘤作用。茯苓多糖具有調(diào)節(jié)固有免疫和抗腫瘤作用[4]。本實驗從大鼠全血分離中性粒細胞,經(jīng)茯苓多糖作用后加入體外培養(yǎng)的腫瘤細胞,通過觀察中性粒細胞在腫瘤細胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)的比例,探討茯苓多糖體外激活中性粒細胞從而抗腫瘤的活性,并對其作用機制進行初步研究。

1 實驗方法

1.1 主要試劑與儀器 DT-500(Pharmacia 公司,Lot.No.307041);Ficoll 分離液(Pharmacia 公司,Lot.No.10038229);胎牛血清(Bioind 公司);RPMI 1640(Sigma公司,Lot.No.688600)。RT-PCR 試劑盒(大連寶生物)。核酸蛋白分析儀(Beckman,Du530);基因擴增儀(Hybaid limited Equipment Class,PE-480);凝膠成像分析儀(Bio Image system Gene Company,Gene Genius);茯苓多糖提取物粉末,天津中醫(yī)藥大學趙駿老師提供;Bel-7402 細胞株,上海潤成生物科技有限公司;SD 大鼠:天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 大鼠PMNs 的分離[5]5月齡大鼠1 只,乙醚麻醉,腹主動脈取血8 mL,加入肝素抗凝的試管中,再加入等體積的6%DT-500,混勻,37℃靜置40 min,取上清,加等體積生理鹽水,1 800 rpm 離心10 min,棄上清,加少量生理鹽水重懸后加至裝有Ficoll 的離心管上層,2 000 rpm 離心18 min,取PMNs 層,生理鹽水洗滌,臺盼藍染色,活細胞數(shù)占總細胞數(shù)95%以上。

1.3 人肝癌細胞株Bel-7402 培養(yǎng) 將Bel-7402 細胞株以含10%胎牛血清(FBS),1%青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶,細胞密度為5×104/mL,隔天換液。待細胞鋪滿瓶底80%時,以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 等體積組成的消化液消化傳代,以含10%FBS、1%青、鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)液重懸,調(diào)整濃度為1×104/mL,種于6 孔板,每孔2 mL,每組3 復孔,培養(yǎng)24 h 備用。

1.4 茯苓多糖對PMNs 活性的影響 將分離出的PMNs 以8×105個/孔接種于6 孔板,加入茯苓多糖,使其終濃度分別為 62.5、31.25、15.625、7.813、3.906 μg/mL,以等量全培養(yǎng)基作對照。作用2 h 后離心,棄上清,用1 mL 全培養(yǎng)基重懸后加入預先培養(yǎng)有Bel-7402 的6 孔板。共培養(yǎng)4 h 后,在倒置相差顯微鏡下觀察,每孔隨機取10 個10×10 倍視野,照像并計數(shù)PMNs 在Bel-7402 細胞周圍形成玫瑰花環(huán)形態(tài)的比例,以3 個或3 個以上PMNs 圍繞在一個Bel-7402 周圍計為一個玫瑰花環(huán)。

1.5 茯苓多糖對PMNs 黏附相關基因表達的影響將原代分離的PMNs 以1×106/mL 種于6 孔板,分為空白PMNs 對照組(全培養(yǎng)基孵育2 h)和茯苓多糖激活PMNs組(7.813 μg/mL 茯苓多糖孵育2 h),每組3復孔。2 h 后1 500 rpm 離心5 min,棄上清,每孔加1 mL Trizol 提取總RNA,RT-PCR 法檢測黏附相關基因TLR-4、CD11b、CD18、MyD88、MAPK-3、NF-κb 等mRNA 的表達。

引物序列根據(jù)Primer3 軟件設計,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫檢測,由上海生工生物技術有限公司合成。序列如下:β-actin:上游AGCCATGTACGTAGCCATCC,下游TC TCAGCTGTGGTGGTGAAG(227bp);TLR-4 上游CAGGG AATTAGGCTCCATGA,下游TCCATGACAGAACGGTCAA A(164bp);MyD88 上游GAGATCCGCGAGTTTGAGAC,下游CTGTTTCTGCTGGTTGCGTA(192bp);MAPK-3 上游ATGAAGGCCCGAAACTACCT,下游ATCCAGCTCCATGTCAAAGG(237bp);NF-κb 上 游GCTTTGCAAACCTGGGAATA,下游TCAGGTCCATCTCCTTGGTC(:225 bp);CD11b 上游CATCACCGTGAGTTCCACAC,下游GAGAACTGGTTCTGGCTTGC (174bp);CD18:上游AGTCCCAGTGGAACAACGAC,下 游 GCACTGGGGCTAGCTGTAAG(161bp)。反應條件:94℃,2 min,1cycle;94℃,30sec,58℃,30sec,72℃,30sec,(其中βactin 擴增28 cycles,其余38 cycles)。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析儀上應用BIO IMAGING SYSTEM(SYNGENE)照像,以目的基因β-actin 灰度比值進行半定量比較分析。計算方法:目的基因灰度比值=目的基因灰度值/β-actin 灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間比較,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同濃度茯苓多糖對PMNs 活性的影響 見表1。

表1 不同濃度茯苓多糖對PMNs 活性的影響()

表1 不同濃度茯苓多糖對PMNs 活性的影響()

注:與對照組比較,#P ＜0.05。

2.2 茯苓多糖對離體PMNs 黏附相關基因表達的影響 見表2。

表2 茯苓多糖對離體PMNs 黏附及活化相關基因表達的影響()

表2 茯苓多糖對離體PMNs 黏附及活化相關基因表達的影響()

注:與對照組比較,#P ＜0.05。

從表2 可以看出,與對照組比較,茯苓多糖可以增加PMNs 黏 附相 關 基因TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11bmRNA 的表達。

3 討論

慢性炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關,慢性炎癥可導致腫瘤形成,炎細胞的募集也可能抗腫瘤產(chǎn)生和腫瘤進展。研究[6]認為,細胞因子的平衡調(diào)節(jié)影響炎癥浸潤的類型和數(shù)量及腫瘤進程:腫瘤產(chǎn)生少量或不產(chǎn)生細胞因子或產(chǎn)生過量抗炎因子,限制炎癥反應和血管形成,限制腫瘤生長;產(chǎn)生大量的促炎癥因子導致炎癥反應達到增加血管新生的地步,則促進腫瘤生長;抗炎和促炎因子失衡,導致大量單核細胞或中性粒細胞浸潤腫瘤時,可有細胞毒和血管新生停滯,結(jié)果腫瘤萎縮

為探討茯苓多糖提高PMNs 對腫瘤細胞趨化黏附作用的機制,檢測了PMNs 炎癥相關因子TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11b、CD18mRNA 的表達。TLR4 是LPS 的跨膜受體,被LPS 激活后可激活MyD88 依賴性信號轉(zhuǎn)導途徑,誘導炎癥基因如NF-κB、TNF-α、MAPK等的表達,誘導免疫反應發(fā)生。Mac-1 是位于白細胞表面的黏附分子,由CD11b 和CD18 2 個亞基組成。吞噬細胞上的CD11b/CD18 對iC3b 調(diào)理的細胞毒性反應需依賴病原體多糖與CD11b 結(jié)合,使CD11/CD18 致敏才能觸發(fā),這些多糖常含甘露糖、葡萄糖等糖基。而iC3b 調(diào)理的腫瘤細胞缺乏適宜的多糖刺激,必須依賴外源性多糖的參與,才能使CD11b/CD18致敏[8]。茯苓多糖主要含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖[9],它有可能致敏CD11b/CD18,觸發(fā)吞噬細胞對腫瘤細胞的毒性反應。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能增加PMNs TLR-4、MyD88、NF-κB 及CD11bmRNA 表達,這可能是其促進白細胞黏附于腫瘤細胞的機制之一?？傊?本實驗研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖可以增加PMNs活性,提高PMNs 對腫瘤的趨化黏附作用,其機制與增加PMNs 黏附 相關 基因TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11bmRNA 的表達相關。

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