王美興，姚堅強，張蓮英，朱金慶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，浙江杭州 310021)

人類對植物遺傳資源的認(rèn)識及考察、收集、利用、創(chuàng)造等有關(guān)研究經(jīng)過了漫長的歷史過程。數(shù)量巨大的資源給保存、評價、鑒定及利用帶來了困難。核心種質(zhì)的提出為上述問題提供了有效解決方案。

1984年澳大利亞的 Frankel［1］提出核心種質(zhì)(core collection)的概念，它是用一定的方法選擇整個種質(zhì)資源的一部分，以最小的資源數(shù)量和遺傳重復(fù)最大程度地代表整個遺傳資源的多樣性。

玉米被引種到中國只有近500年的歷史［2］，一方面遺傳基礎(chǔ)相對狹窄依然是制約我國玉米育種的瓶頸;另一方面我國育種家通過收集地方種，二環(huán)系，誘導(dǎo)突變，雜交回交，引進國外優(yōu)良種質(zhì)資源等多種方式收集創(chuàng)造了數(shù)量巨大的遺傳材料。因此構(gòu)建玉米核心種質(zhì)，更高效、深入地利用玉米種質(zhì)資源尤為重要，以糧用飼用為主的中國玉米地方種核心種質(zhì)已經(jīng)構(gòu)建起來［3］。鮮食玉米的核心種質(zhì)構(gòu)建報道較少。作者以浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鮮食玉米資源的初級核心種質(zhì)為對象，對鮮食玉米遺傳多樣性，遺傳結(jié)構(gòu)及核心種質(zhì)的構(gòu)建進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為348份玉米初級核心種質(zhì)，該核心種質(zhì)是通過對3 560份玉米種質(zhì)資源利用6個農(nóng)藝性狀聚類取樣獲得的，初級核心種質(zhì)對總資源的代表性達(dá)到95%。初級核心種質(zhì)從類型上可分為糯玉米 (96份)，甜玉米 (156份)，甜糯玉米 (63份)和普通玉米 (36份)4種類型，其中普通玉米及糯玉米中的14份材料為地方種，其他材料均為二環(huán)系自交系。

1.2 SSR等位變異檢測

DNA提取采用CTAB法［4］，從小量冷凍葉片提取DNA。SSR引物序列來自 http://www．maizegdb.org/ssr.php，所用30個SSR引物平均分布于10條染色體上。PCR反應(yīng)體系為:Taq酶0.9 U，10 ×緩沖液1.5 μL。MgCl222.5 mmol·L－1。SSR 引物46 ng，dNTP 1.8 mmol·L－1，總體積為15 μL。PCR反應(yīng)步驟為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，退火 (視引物而定)1 min，72℃延伸90 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，染色方法為銀染法［5］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用等位變異數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息指數(shù)來描述鮮食玉米遺傳多樣性，上述參數(shù)的計算是用POWERMARKER 3.25［6］和遺傳結(jié)構(gòu)分析用軟件 STRUCTURE［7］完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米初級核心種質(zhì)遺傳多樣性

在初級核心種質(zhì)348份材料中，利用30個SSR標(biāo)記位點，共檢測到183個等位變異，等位變異數(shù)變化范圍為3～9個，平均每個位點有6.1個等位變異;基因多樣性指數(shù)最高達(dá)到0.84。平均基因多樣性指數(shù)為0.65，SSR位點的平均多態(tài)性指數(shù)為0.61(表1)。

表1 玉米初級核心種質(zhì)在各SSR位點的遺傳多樣性

不同類型的玉米之間遺傳多樣性有一定的差異(表2，圖1)。等位變異數(shù)量最多的是甜玉米，最少的是普通玉米;基因多樣性最高的是糯玉米，最低的是普通玉米。SSR位點的多態(tài)性與基因多樣性的高低在各類玉米資源中的大小分布是一致的。普通玉米全部為地方種，其等位變異數(shù)和基因多樣性指數(shù)都最低。

從4種玉米類型之間的遺傳關(guān)系來看，糯玉米、普通玉米與另外3種類型遺傳差異較大。雖甜玉米與甜糯玉米有較近的遺傳關(guān)系，但兩者之間的

表2 不同類型玉米群體的遺傳多樣性

圖1 4種玉米類型群體之間的遺傳關(guān)系

表3 3種玉米類型群體之間的遺傳距離

2.2 玉米初級核心種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)

為了考察玉米的傳統(tǒng)分類和利用分子標(biāo)記所獲得的遺傳結(jié)構(gòu)是否一致，本研究以348份玉米初級核心種質(zhì)材料個體為單位進行了聚類分析，結(jié)果(圖2)顯示，甜玉米、糯玉米、普通玉米和甜糯玉米都沒有單獨聚為一類。4種類型的材料在以分子標(biāo)記數(shù)據(jù)聚類所形成的群體中幾乎是隨機分布的，表明傳統(tǒng)的玉米分類方式不能確切、真實地代表其遺傳結(jié)構(gòu)。因此在構(gòu)建核心種質(zhì)時，以傳統(tǒng)分類為依據(jù)進行分群不能保證核心種質(zhì)的代表性。圖2顯示初級核心種質(zhì)材料在不同的遺傳距離尺度下可以分成若干群體，但是以哪種遺傳距離尺度進行遺傳結(jié)構(gòu)的劃分較為合理尚不能確定，為了解決這個問題，本研究利用遺傳結(jié)構(gòu)分析軟件STRUCTURE對玉米初級核心種質(zhì)進行了遺傳結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

圖3顯示的是當(dāng)給定不同的分群數(shù)量，即K值時，由STRUCTURE獲得的△K值與K值之間的變化關(guān)系，當(dāng)K=4時，△K具有穩(wěn)定值，并且隨著K值的繼續(xù)增大，逐漸變得不穩(wěn)定。因此玉米初級核心種質(zhì)最佳分成4個遺傳群體。

圖2 玉米初級核心種質(zhì)個體材料聚類圖

圖3 玉米初級核心種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)最佳分群數(shù)量

根據(jù)分子標(biāo)記所獲得的4個遺傳群體 (表4)與玉米的傳統(tǒng)分類方式的確有較大的差異，甜玉米，糯玉米，普通玉米及甜糯玉米的個體材料在結(jié)構(gòu)群體中是隨機分布的。4個遺傳結(jié)構(gòu)群體材料數(shù)量差異不大，其中遺傳多樣性最高的是群體4，最低的是群體3。

表4 玉米初級核心種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)群體的遺傳多樣性

2.3 核心種質(zhì)取樣方法的確定

為了確定核心種質(zhì)最佳取樣方法，本研究對比研究了隨機取樣與聚類取樣過程中等位變異、基因多樣性的捕獲效率、保留比例的變化規(guī)律，以及等位變異保留比例，基因多樣性和核心種質(zhì)取樣規(guī)模的關(guān)系。

在隨機取樣時，隨著取樣比例的增加，取樣群體捕獲到的等位變異數(shù)量持續(xù)增加，而基因多樣性指數(shù)則是先迅速增大，達(dá)到最大值以后，隨著材料數(shù)的增加，基因多樣性表現(xiàn)為無序振蕩 (表5)。圖4和5更直觀地給出了等位變異數(shù)和基因多樣性隨著取樣群體規(guī)模變化的規(guī)律。當(dāng)取樣比例達(dá)到50%時，取樣群體的基因多樣性達(dá)到最高，而且此時等位變異保留比例隨著群體增大而增大的幅度不明顯。從玉米初級核心種質(zhì)到核心種質(zhì)，若采用隨機取樣的方法取樣，50%的取樣比例最佳。

表5 隨機取樣時不同取樣比例下各群體的遺傳多樣性及代表性

圖4 隨機取樣時基因多樣性指數(shù)與取樣比例的關(guān)系

圖5 隨機取樣時基因等位變異數(shù)與取樣比例的關(guān)系

在聚類取樣時，隨著取樣比例的增加，取樣群體捕獲到的等位變異數(shù)量持續(xù)增加，而基因多樣性指數(shù)則是先迅速增大，然后逐漸減小 (表6)。這是因為當(dāng)取樣群體過大時，雖然仍然有新的等位變異被捕獲，但是增加大量的遺傳冗余而導(dǎo)致基因多樣性的降低。圖6和7是等位變異數(shù)和基因多樣性隨著取樣群體規(guī)模的變化規(guī)律。當(dāng)取樣比例為40%時，基因多樣性達(dá)到最大，而且此時等位變異的保留比例達(dá)到了95%，隨著群體的繼續(xù)增大，等位變異增加的幅度不明顯。因此鮮食玉米從初級核心種質(zhì)到核心種質(zhì)，利用聚類方法取樣，最佳取樣比例是40%，取樣材料數(shù)量約為136份。通過比較隨機取樣與聚類取樣2種取樣方法的等位變異捕獲速度和基因多樣性指數(shù)的變化規(guī)律，可以發(fā)現(xiàn)，聚類取樣的效率要遠(yuǎn)高于隨機取樣，利用聚類方法構(gòu)建核心種質(zhì)所需要的群體要小于利用隨機方法。因此聚類取樣方法更適合從初級核心種質(zhì)到核心種質(zhì)的取樣工作。

2.4 核心種質(zhì)的生成

圖6 聚類取樣時基因多樣性指數(shù)與取樣比例的關(guān)系

圖7 聚類取樣時等位變異數(shù)與取樣比例的關(guān)系

核心種質(zhì)取樣分組方式包括按資源類型分組、按遺傳結(jié)構(gòu)分組等分組方式。本研究通過遺傳結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)鮮食玉米分類方式比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的分類方式不能夠代表鮮食玉米的遺傳結(jié)構(gòu)，因此采取利用鮮食玉米初級核心種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)分群方式進行分組，即初級核心種質(zhì)共分為4組 (表4)。取樣數(shù)量在群體間的分配方式包括等比例分配，同比例分配，根據(jù)遺傳多樣性進行分配等方式。本研究中4個遺傳結(jié)構(gòu)群體的材料數(shù)量比較接近，等比分配和同比分配的差異較小，而其遺傳多樣性指數(shù)差異也不明顯 (表4)，因此本研究直接采取組間同比分配的策略。同比分配即每組取樣都按40%進行聚類取樣，最終得到核心種質(zhì)的群體大小為139份材料，捕獲的等位變異數(shù)位176個，等位變異代表性為96.2%。其遺傳多樣性指數(shù)為0.66，核心種質(zhì)的基因多樣性高于初級核心種質(zhì)的基因多樣性。

表6 聚類取樣時不同取樣比例下各群體的遺傳多樣性相對于初級核心種質(zhì)的代表性

3 討論

3.1 中國玉米資源遺傳多樣性現(xiàn)狀及應(yīng)對策略

前人對不同類型、不同地區(qū)的玉米資源曾經(jīng)做過遺傳多樣性的考察。姚啟倫等［8］在中國西南玉米地方種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)每個SSR位點上的等位變異數(shù)為2～15個，平均6.4個;平均基因多樣性指數(shù)為0.76。王明泉等［9］利用52份北方玉米自交系的遺傳多樣性，每個SSR位點獲得了2～8個等位變異，平均4.35個，SSR位點的平均多態(tài)性指數(shù)為0.593。肖木輯等［10］在我國黃淮海地區(qū)玉米自交系中，每對SSR引物檢測到等位基因2～7個，平均3.96個，每個位點的多態(tài)性信息量0.177～0.827，平均0.581。與上述研究結(jié)果相比，鮮食玉米遺傳資源的遺傳多樣性要高于部分地區(qū)的地方種及生產(chǎn)中的骨干自交系，本研究中的遺傳資源絕大部分是通過國內(nèi)國外優(yōu)良鮮食玉米品種經(jīng)過多帶自交獲得的自交系，因此材料來源更為廣泛，遺傳基礎(chǔ)相對較為豐富。

與世界其他國家尤其是玉米起源或種植歷史較早的玉米遺傳資源相比，中國玉米資源的遺傳多樣性較低。Hoxha等［11］利用20個SSR位點研究了阿爾巴尼亞玉米資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)每個SSR位點的平均等位變異數(shù)為9.1。Liu Kejun等［12］考察了來自美國、歐洲、加拿大、南非和泰國260份玉米資源，發(fā)現(xiàn)每個SSR位點的平均等位變異數(shù)為21.7。Vigouroux等［13］的研究結(jié)果表明美洲玉米遺傳資源平均每個SSR位點上的等位變異達(dá)到39個。解決中國玉米遺傳資源極為匱乏這個瓶頸，要做好2個方面的工作:首先是加強國外資源的引進;另外是要通過構(gòu)建核心種質(zhì)，充分、高效的利用現(xiàn)有資源。

3.2 鮮食玉米的遺傳結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)分類的關(guān)系

通過對玉米遺傳資源以傳統(tǒng)分類群體為單位進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)普通玉米和鮮食玉米之間有最遠(yuǎn)的遺傳距離，糯玉米和其他類型玉米之間的遺傳距離次之，甜玉米和甜糯玉米之間的遺傳關(guān)系最近，表明普通玉米和鮮食玉米之間有分化現(xiàn)象。因為鮮食玉米的糯性和甜度作為隱性單基因控制的性狀，在育種和自交系構(gòu)建時需要與普通玉米進行生殖隔離，這種隔離可能是造成鮮食玉米和普通玉米之間遺傳分化的動力。盡管玉米在中國的種植歷史只有500年左右［2］，遺傳資源的數(shù)量有限，而且遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，但是中國云南是公認(rèn)的糯玉米起源地之一［14］。本研究結(jié)果表明糯玉米群體和甜玉米及普通玉米有較遠(yuǎn)的遺傳距離。這可能是長期的地理空間隔離及生殖隔離共同作用造成了糯玉米與其他玉米群體之間的分化。云貴地區(qū)糯玉米資源研究過程中也發(fā)現(xiàn)，云貴地區(qū)的糯玉米與其他地區(qū)的玉米遺傳資源有較大遺傳差異，不是僅僅表現(xiàn)在wax基因的差異上［15］。因此玉米資源遺傳結(jié)構(gòu)的形成不僅是單基因突變導(dǎo)致的，而是由生態(tài)隔離或空間隔離促成的。甜玉米在中國種植的歷史較短，大部分甜玉米資源為近期從國外引種而來，國外甜玉米資源與國內(nèi)玉米資源也同時存在空間隔離，這是造成甜玉米和其他類型玉米之間有較遠(yuǎn)遺傳關(guān)系的原因之一。以單份材料為單位進行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)4種玉米類型的材料并都沒有被單獨地聚成一類，而是隨機地出現(xiàn)在若干結(jié)構(gòu)群體中。表明，雖然糯玉米、甜玉米、普通玉米及甜糯玉米之間有了分化，但是分化水平不高。糯玉米和甜玉米是由普通玉米通過單基因突變形成的玉米類型，從起源上來看和普通玉米沒有本質(zhì)的差別，另外部分甜、糯玉米資源的改良是通過與普通玉米人工控制雜交、回交實現(xiàn)的，因此部分甜玉米、糯玉米、普通玉米及甜糯玉米在整個基因組上表現(xiàn)為較近的遺傳關(guān)系，甚至被劃分到同一個遺傳群體中也是合理的。

3.3 核心種質(zhì)構(gòu)建是最大代表性和最少材料數(shù)這一對矛盾的相對平衡

構(gòu)建核心種質(zhì)的目的在于以最小的樣本規(guī)模達(dá)到最大限度地代表整個遺傳資源群體的遺傳多樣性。但是核心種質(zhì)遺傳代表性和資源數(shù)量之間存在非線性關(guān)系［7］。核心種質(zhì)所包含的遺傳變異數(shù)量隨著材料數(shù)量的增加而增加，但是增加的幅度逐漸減小，因此隨著核心種質(zhì)材料數(shù)量的增加，捕獲遺傳變異的效率是逐漸降低的，引入核心種質(zhì)的遺傳冗余度也逐漸增大。核心種質(zhì)的代表性和實用性(最大代表性和最少材料數(shù))是一對矛盾，而且不同的遺傳資源等位變異的捕獲效率和相等取樣規(guī)模時群體的基因多樣性是不同的，因此在構(gòu)建核心種質(zhì)時不同的遺傳資源的取樣比例沒有可比性。目前還未有用最小的資源樣本規(guī)模實現(xiàn)最大程度地代表整個遺傳資源取樣方法的報道。

研究等位變異的保留比例即等位變異的代表性和取樣數(shù)量之間的關(guān)系結(jié)果表明，利用聚類方法當(dāng)取樣比例達(dá)到40%的時候，其等位變異的代表性已經(jīng)達(dá)到96.2%，基本代表了全部初級核心種質(zhì)的遺傳多樣性。此時的材料數(shù)為139份，占整個遺傳資源的4%。根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)進行分組，利用聚類方法進行取樣，通過考察等位變異保留比例和取樣比例之間的關(guān)系確定最佳取樣規(guī)模進行核心種質(zhì)構(gòu)建的方法是可行的。

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