杜 宇，蔡洪洋，周 哲，李鵬飛，龐宜婧

（1.中國刑事警察學(xué)院 法醫(yī)系,遼寧 沈陽 110035；2.沈陽市公安局 鐵西分局,遼寧 沈陽 110023；3.沈陽市公安局 交警支隊(duì),遼寧 沈陽 110041）

硅藻檢驗(yàn)在診斷溺死的作用中一直存在爭議，但由于水中尸體常處于腐敗甚至高度腐敗狀態(tài)，僅根據(jù)尸表、解剖及病理組織學(xué)檢查有時很難鑒定溺死或拋尸入水，因此目前在一些法醫(yī)檢案中，硅藻檢驗(yàn)仍是一種有效甚至唯一的鑒定手段[1]。由于受環(huán)境、水文等多種因素影響，不同季節(jié)同一水域中硅藻數(shù)量及種群構(gòu)成的差異可能很大。本研究依據(jù)不同季節(jié)溺死尸體及家兔作為研究對象，分析溺水死亡者肺、肝、腎等器官淡水硅藻檢驗(yàn)結(jié)果可能存在的季節(jié)性差異，以期為法醫(yī)學(xué)水中尸體死因鑒定等提供技術(shù)幫助。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

臺式高速離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速16000r/min），離心管（15ml），移液器，加樣槍頭，生物顯微鏡，恒溫干燥箱，電子天平，蒸餾水，硝酸，胰蛋白酶。

1.2 檢材及分組

1.2.1 尸體材料

收集2009～2011年1、4、7、10月沈陽市渾河中溺死尸體共20例，每月5例。尸體均未明顯腐敗，系統(tǒng)尸體解剖均具備明顯溺死征象，失蹤至發(fā)現(xiàn)尸體時間均不超過3d，提取肺、肝、腎各20g、股骨骨髓5g備檢。

1.2.2 現(xiàn)場水樣提取

20例發(fā)現(xiàn)尸體現(xiàn)場分別以尸體打撈點(diǎn)及以尸體打撈點(diǎn)為中心，5m為半徑共設(shè)5個取水點(diǎn)，每個取水點(diǎn)取水面及水面下30cm水樣各500ml，每個現(xiàn)場共提取10份水樣，加4%甲醛溶液固定，靜置24h后鏡檢。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康新西蘭大白兔45只（遼寧中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量2.5～3.0kg，雌雄不限，隨機(jī)分為空白對照組，冬季（1月）、春季（4月）、夏季（7月）、秋季（10月）溺死組及死后入水組共9組，每組5只。2011年1、4、7、10月水中尸體發(fā)現(xiàn)后第2天于打撈尸體現(xiàn)場，將當(dāng)月生前溺死組兔置兔籠中，沉入水下0.3m，2min后提出水面30s重新沉入相同水深處，重復(fù)3～5次使大白兔緩慢溺死，死后水中浸泡30min；死后溺尸組采用空氣栓塞法處死后，同一時間置于相同水域同樣深度浸泡30min后取出。對照組經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞致死。提取各組兔肺、肝、腎各3g，股骨骨髓0.5g備檢。

1.3 方法

1.3.1 現(xiàn)場水樣硅藻種屬觀察及優(yōu)勢度計算

檢驗(yàn)前確定儀器及試劑均不含硅藻。將現(xiàn)場水樣震蕩混勻，每個現(xiàn)場提取的10份水樣，分別提取50ml于燒杯內(nèi)滴加少量濃硝酸并微微加熱去除有機(jī)質(zhì)，取10ml裝入離心管，以離心半徑8cm，12000 r/min離心10min，棄上清液后定容至1ml，蒸餾水洗5min×3次，每次均棄上清液，最終定容至0.5ml，用移液器反復(fù)吹吸沉淀物使之充分混勻后，均勻涂片5張鏡檢并計數(shù)。（1）觀察硅藻形態(tài)，依據(jù)文獻(xiàn)[2]進(jìn)行硅藻種屬鑒定；（2）計數(shù)10ml水樣中硅藻數(shù)量平均值，并根據(jù)各藻種出現(xiàn)的頻率及個體數(shù)量進(jìn)行各屬硅藻優(yōu)勢度計算，優(yōu)勢度：Y=（Ni/N）fi。式中Ni為樣品中某屬硅藻數(shù)量，N為樣品中硅藻總數(shù)量，fi為樣品中某藻出現(xiàn)頻率，Y＞0.02即為優(yōu)勢種群。

1.3.2 人及兔各器官硅藻計數(shù)及種屬觀察

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場水樣檢測結(jié)果

水樣中共鑒定出硅藻9屬，隸屬于2綱5目5科，分別是中心綱直鏈藻屬、小環(huán)藻屬、冠盤藻屬、四棘藻屬；羽紋綱脆桿藻屬、舟形藻屬、等片藻屬、橋彎藻屬、菱形藻屬。各月水樣中硅藻種群及優(yōu)勢度見表1。

表1 不同季節(jié)水樣中硅藻種群及相應(yīng)優(yōu)勢度

2.2 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

家兔各溺死組解剖均可見肺體積膨大，重量較對照組顯著增加，空白對照組肺質(zhì)量：左4.05±1.21g，右6.31±1.39g。溺死組肺質(zhì)量：左6.66±1.32g，右8.27±1.51g。雙肺邊緣鈍圓，切面見多量泡沫狀血性液流出，水性肺氣腫特征明顯。各溺死組家兔器官及現(xiàn)場水樣硅藻檢出結(jié)果見表2。死后入水組及空白對照組器官中均未檢出硅藻。

2.3 溺死尸體檢驗(yàn)結(jié)果

各例尸體均口鼻部蕈樣泡沫、呼吸道內(nèi)溺液、水性肺氣腫等溺死征象明顯，解剖檢驗(yàn)、組織學(xué)病理檢查及毒化檢驗(yàn)可排除其它致死原因，后期案件跟蹤進(jìn)一步支持溺死。各組死者肺中均可檢出多量硅藻，且同季水樣中各屬硅藻均可見；春、秋及冬季肝、腎組織中可檢出少量小環(huán)藻、直鏈藻、冠盤藻等中心綱硅藻，春秋季骨髓中可檢出少量小環(huán)藻；夏季溺死組肝、腎及骨髓均未檢出硅藻（見表3～4）。

表2 家兔溺死組器官中淡水硅藻檢出量及檢出率 （n=5，）

表3 溺死尸體各臟器中淡水硅藻檢出量及檢出率 （n=5，）

表4 溺死尸體各臟器中淡水硅藻檢出種群

3 討論

硅藻是一類細(xì)胞壁高度硅質(zhì)化的單細(xì)胞植物，是浮游生物的重要組成成分，其種群繁多、數(shù)量龐大，耐受力強(qiáng)，生境廣泛，可在淡水、咸水中生長，浮游或著生，部分硅藻對低溫具有極強(qiáng)的耐受性，甚至可以在冰層下正常生長繁殖[3]。硅藻具有明顯的地區(qū)多樣性分布特點(diǎn)，尤其在江河、湖泊等淡水系統(tǒng)中，其群落組成及數(shù)量變化與環(huán)境、水文的改變有著極其密切的關(guān)系[4-6]。

本研究檢測同一水域中不同季節(jié)的硅藻，結(jié)果顯示淡水河流中硅藻的數(shù)量及種群構(gòu)成存在明顯季節(jié)性差異。在沈陽地區(qū)，冬季（1月）淡水河流中僅可檢見小環(huán)、直鏈、冠盤、四棘等小型中心綱硅藻屬；春（4月）秋季（10月）小環(huán)、直鏈、舟形、脆桿等中心綱及羽紋綱硅藻屬混雜存在，硅藻數(shù)量明顯高于冬季及夏季組；夏季（7月）舟形藻屬、脆桿藻屬、等片藻屬等體積較大的羽紋綱硅藻成為優(yōu)勢種，較小的小環(huán)藻屬、直鏈藻屬等中心綱硅藻稀少。已有研究證實(shí)，不同季節(jié)硅藻數(shù)量及種群構(gòu)成可能與流速、水溫、光照及藻類間競爭抑制等多種因素有關(guān)[4-9]。綜合環(huán)境及水文因素，春秋季是最適宜硅藻生長的時段，淡水中硅藻數(shù)量最多，由于流速較慢，此期間中心綱小型硅藻因具有相對較高的比表面積在水體中占據(jù)優(yōu)勢[10]。夏季因藍(lán)藻等藻類常形成水華優(yōu)勢種，遮蔽水體表面對硅藻類形成光競爭優(yōu)勢造成硅藻數(shù)量少于春秋季[11]，同時夏季流速快，水體的攪動有利于羽紋綱等大型硅藻[12]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，說明硅藻種群存在明顯的季節(jié)性變化。

依據(jù)傳統(tǒng)分類法，我國淡水硅藻分為中心綱及羽紋綱兩個綱，約200個屬。中心綱及羽紋綱硅藻在種類、形態(tài)及大小上存在顯著差別，中心綱硅藻體積較小，多數(shù)直徑30μm以下，僅少數(shù)種屬直徑可達(dá)70μm以上，其中直鏈藻、小環(huán)藻及冠盤藻各屬部分種的直徑介于3～10μm間。羽紋綱硅藻體積多較大，呈長方體狀，長25～260μm，寬3～35μm不等，我國常見種群僅少數(shù)長度在35μm以下[2]。本研究結(jié)果顯示春秋季較小的中心綱及較大的羽紋綱硅藻混雜出現(xiàn)，冬季水體中僅見體積小的小環(huán)藻等中心綱硅藻，夏季則體積大的舟形藻等羽紋綱硅藻成為優(yōu)勢種，說明由于硅藻種群存在明顯的季節(jié)性變化可能造成不同季節(jié)水體中硅藻體積的明顯差異。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)同在嚴(yán)格控制操作污染后，從肺、肝、腎、骨髓等多個器官中檢出硅藻，并與現(xiàn)場水樣種群一致，方可確定溺死[13-14]。本研究檢驗(yàn)1、4、7、10月份每月內(nèi)近似同一時間點(diǎn)溺死的人及家兔的肺、肝、腎、骨髓中硅藻，發(fā)現(xiàn)各季溺死者肺中均可檢出多量與水樣中同屬硅藻，而肝、腎及骨髓中硅藻檢出率則存在季節(jié)性差異，特別是夏季溺死者肝、腎及骨髓中均未檢出硅藻。分析其原因可能與硅藻種群的季節(jié)性變化及不同屬硅藻體積的差異有關(guān)。一般認(rèn)為活體溺水過程中，大量大小為8～15μm的硅藻隨溺液進(jìn)入肺泡，并從破裂的肺泡毛細(xì)血管進(jìn)入肺靜脈，到左心后隨體循環(huán)到達(dá)全身各器官[14-15]。人體肺泡大小不一，平均直徑約200μm，表面密布毛細(xì)血管網(wǎng)，毛細(xì)血管管徑平均為6～8μm，僅可容單個紅細(xì)胞通過，毛細(xì)血管壁無肌組織，擴(kuò)張可能僅依靠其管壁少量孤立的周細(xì)胞（在肺毛細(xì)血管中與內(nèi)皮細(xì)胞比例僅為1︰10）完成，目前雖沒有肺泡壁毛細(xì)血管管徑可擴(kuò)張的最大數(shù)值，但考慮其原始管徑小及周細(xì)胞數(shù)量少，分析其擴(kuò)張功能有限。兩條或多條毛細(xì)血管匯集成管徑不超過30μm的毛細(xì)血管后微靜脈，其管壁亦不含肌組織，只有進(jìn)一步匯集成管徑達(dá)30μm以上微靜脈時，才會具有肌細(xì)胞。綜前所述分析，中心綱硅藻中直鏈藻、小環(huán)藻等體積較小硅藻屬種，理論上可通過原始狀態(tài)或擴(kuò)張的毛細(xì)血管腔并進(jìn)入體循環(huán)，而羽紋綱硅藻體大且長，難以或不能被毛細(xì)血管腔容納，加之溺死過程中，嚴(yán)重肺淤血使微循環(huán)血流速度進(jìn)一步減慢，更加大了較大型硅藻通過微靜脈而入體循環(huán)的可能。因此，硅藻種屬的季節(jié)性變化及不同種屬硅藻體積的差異可能造成了肝、腎等大循環(huán)器官中硅藻檢出率的季節(jié)性差異。本研究還發(fā)現(xiàn)，各季溺死家兔肺中僅檢出小環(huán)藻、直鏈藻、冠盤藻等較小中心綱硅藻，肝、腎等體循環(huán)器官中均未檢出硅藻，分析可能是由于其肺泡及毛細(xì)血管管腔較人類更加狹窄，較大硅藻難以進(jìn)入，進(jìn)一步說明水體中優(yōu)勢硅藻大小的差異可能影響臟器中硅藻檢出率。

綜上，本研究結(jié)果提示由于硅藻種群的季節(jié)性變化特點(diǎn)及不同種屬硅藻體積的差異可能造成肝、腎等大循環(huán)器官中硅藻檢出率的季節(jié)性差異?？紤]進(jìn)入肺組織的硅藻需經(jīng)較長距離的體循環(huán)到達(dá)肝、腎及傳統(tǒng)的硝酸乙醇法僅能檢出無機(jī)硅藻，使大量有機(jī)硅藻破壞[16]，加之離心處理步驟導(dǎo)致的硅藻損失[17]，均可能造成肝、腎等體循環(huán)臟器中硅藻檢出率進(jìn)一步降低。因此僅肺中檢出硅藻，而肝、腎硅藻檢驗(yàn)結(jié)果陰性并不能排除溺死可能，水中尸體需結(jié)合尸檢所見、細(xì)致的組織病理學(xué)檢查及毒化分析等綜合推斷死因。

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