關(guān)統(tǒng)偉，趙輝平，車振明

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都 610039)

大英鹽湖位于四川省中部地區(qū)的遂寧市大英縣境內(nèi)，1.5億年前地球的兩次造山運(yùn)動(dòng)在四川大英縣形成了地下古鹽湖盆地，含鹽量超過22%，其鹽鹵儲(chǔ)量達(dá)42億 t［1］。2011年自大英鹽湖中分離獲得1株極端嗜鹽產(chǎn)孢放線菌，菌株編號(hào)為TRM4064，經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析初步確定為1株潛在的新種，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)和分子遺傳學(xué)等多相分類手段的測定，確認(rèn)菌株TRM4064為多孢放線菌屬(Actinopolyspora)的一個(gè)新種。研究目的是通過多相分類技術(shù)確定該菌種的系統(tǒng)分類地位。多相分類是采用現(xiàn)代分類的多種方法，綜合表現(xiàn)型和遺傳型信息進(jìn)行分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究的過程，它是當(dāng)前研究微生物各級(jí)分類單位最有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2011年12月自大英鹽湖樣品中分離獲得的1株極端嗜鹽放線菌，菌株編號(hào)為TRM4064。

1.1.2 主要試劑及儀器 QIAquik PCR純化試劑盒(QIAGEN)、蛋白酶 K(Merck)、Taq酶(TaKa-Ra)、dNTPs(TaKaRa)、DNA Marker(Sangon)，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。凝膠成像儀(Biorad)、電泳儀(Bio-rad)、PCR 擴(kuò)增儀(Bio-rad)。

1.2 方法

1.2.1 菌種形態(tài)特征觀察和生理生化實(shí)驗(yàn) 用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株的形態(tài)和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。碳、氮源生長實(shí)驗(yàn)采用Mata等［2］建議的培養(yǎng)基(NaCl 100 g，KCl 2 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，KNO31 g，(NH4)2HPO41 g，KH2PO40.5 g);抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)和其他生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［2-3］描述的方法進(jìn)行。

1.2.2 菌種醌、脂肪酸及細(xì)胞全水解糖組分分析微生物細(xì)胞醌組分的提取和純化參照Collins［4］的方法，然后根據(jù)Groth［5］的方法，利用高壓液相色譜(HPLC)測定醌組分。細(xì)胞脂肪酸采用Sasser［6］的方法測定。放線菌全細(xì)胞水解糖分析主要參照Hasegawa等［7］描述的方法。

1.2.3 DNA(G+C)mol% 的測定與 DNA-DNA分子雜交 根據(jù)文獻(xiàn)［8］的程序?qū)闠RM4064進(jìn)行(G+C)mol%的測定，采用高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析。DNA-DNA分子雜交方法主要依照 Ezaki［9］和徐麗華等［3］所描述的方法進(jìn)行。

1.2.4 16S rRNA基因測定與系統(tǒng)進(jìn)化分析DNA的提取和 PCR擴(kuò)增程序采用 Hezayen［10］的方法，然后將PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測序。用Blast搜索程序從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用 CLUSTAL_X進(jìn)行多序列比對，使用MEGA4.0 軟件采用鄰接法［11］聚類分析，并構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時(shí)，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析來評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型特征

菌株TRM4064是好養(yǎng)性微生物，具有很強(qiáng)的嗜鹽性，革蘭染色陽性，產(chǎn)生發(fā)達(dá)的孢子。氣生菌絲持續(xù)生長形成孢子鏈，孢子鏈上含有10個(gè)以上的孢子，孢子鏈呈直線型，孢子有橢圓形和圓柱形，表面光滑，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生孢子囊，見圖1。

圖1 TRM4064菌株的電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron micrograph of strain TRM4064

菌株TRM4064能夠在28～55℃范圍內(nèi)生長，能夠耐受10% ～20%的NaCl鹽濃度，可以在pH值為6～8的培養(yǎng)基上生長。氧化酶實(shí)驗(yàn)為陰性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，吲哚實(shí)驗(yàn)和甲基紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。硝酸鹽不能夠被還原，牛奶凝固不被胨化，H2S實(shí)驗(yàn)為陽性。Tween 20、Tween 40、Tween 60和 Tween 80水解，纖維素分解，明膠被液化，酪蛋白被水解，但淀粉和尿酶水解為陰性。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌對ampicillin(10 μg)、azithromycin(15 μg)、carbenicillin(100 μg)、chloramphenicol(30 μg)、gentamicin(120 μg)、erythromycin(15 μg)、lincomycin(2 μg)、nitrofurantoin(300 μg)、tobramycin(10 μg)、novobiocin(30 μg)、rifampicin(30 μg)、tetracycline(30 μg)、streptomycin(10 μg)和 vancomycin(30 μg)敏感，但對 kanamycin(30 μg)、polymyxin B(300 UI)和 nalidixic acid(30 μg)不敏感。菌株TRM4064另外的一些表型特征及其與最近的同源菌株的差異性見表1。在表型特征上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持該菌為一個(gè)新的物種。

表1 菌株TRM4064與最近同源菌株的表型差異Table 1 Differential characteristics of strain TRM4064 and Actinopolyspora mortivallis

2.2 全細(xì)胞水解糖、醌、脂肪酸組分及其細(xì)胞壁磷脂分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，菌株TRM4064的主要的泛醌為 MK-10(H4)(38.2%)、MK-9(H4)(25.1%)、MK-9(H2)(28.6%)和 MK-8(H4)(7.3%)，TRM4064的主要泛醌與多孢放線菌屬的醌型基本一致，只是在含量上有一定的差異。如Actinopolyspora erythraea的優(yōu)勢醌為MK-9(H4)(51.9%)，Actinopolyspora alba 的優(yōu)勢醌為 MK-9(H4)(44.9%)和 MK-10(H4)(43.9%)［12］。菌株TRM4064細(xì)胞內(nèi)主要的脂肪酸組分及其含量是 anteiso-C17:0(36.9%)和 iso-C17:0(19.3%)，這與親緣菌株Actinopolyspora mortivallis基本一致，在脂肪酸組分及其含量上與Actinopolyspora mortivallis有一定的差異性，具體的脂肪酸信息見表2。菌株TRM4064的全細(xì)胞水解糖分組成是木糖、葡萄糖、核糖和阿拉伯糖，與Actinopolyspora菌屬的細(xì)胞水解糖糖型一致。薄板層析法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株TRM4064的細(xì)胞磷脂是心磷脂、磷脂酰甘油、卵磷脂、磷脂酰肌醇和2個(gè)未知的磷脂類型，與該屬的磷脂組成相一致。

表2 菌株TRM4064與Actinopolyspora mortivallis的脂肪酸組成成分比較Table 2 Fatty acid profiles of strain TRM4064 and Actinopolyspora mortivallis

菌株TRM4064在全細(xì)胞水解糖、醌型、磷脂和脂肪酸組分分析上具有Actinopolyspora菌屬的典型特征，且存在一定的差異。因此，在細(xì)胞化學(xué)水平上支持菌株TRM4064為Actinopolyspora菌屬的一個(gè)新種。

2.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析與 DNA-DNA雜交

菌株TRM4064的16S rRNA基因序列測定結(jié)果表明，序列長度大約1 500 bp。采用EzTaxon server 2.1工具比較其菌株的16S rRNA基因與有效命名物種的序列進(jìn)行序列比對，菌株TRM4064與Actinopolyspora mortivallis的同源性為98.8%，同Actinopolyspora菌屬另外有效命名的物種的相似性小于97%。因此，需要進(jìn)行核酸雜交來驗(yàn)證其是否為新的物種。根據(jù)Wayne等［13］的描述，DNA雜交值低于70%可作為不同的種。根據(jù)雜交結(jié)果菌株TRM4064同Actinopolyspora mortivallis的雜交值為23.2%，表明菌株TRM4064是在Actinopolyspora屬之內(nèi)且不同于已知種的新物種。采用CLUSTALX軟件與已知親緣關(guān)系較近的物種進(jìn)行序列比對，MEGA4.0軟件進(jìn)行相似性計(jì)算、進(jìn)化距離矩陣計(jì)算、聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建等系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2。

菌株 TRM4064系統(tǒng)發(fā)育表明，菌株TRM4064同親緣關(guān)系最近的Actinopolyspora菌屬的物種以極高的自展值(＞98%)聚類在一起，形成獨(dú)立的大分支單元，這與EzTaxon server 2.1工具分析的結(jié)果相一致。因此，系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株 TRM4064是 Actinopolyspora菌屬的一個(gè)成員。

圖2 菌株TRM4064同已知同源關(guān)系較近菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences，showing the phylogenetic relationships of the novel isolate TRM4064 and related taxa

2.4 (G+C)mol%測定

DNA的堿基組成具有種特異性，不受菌齡和外界因素的影響，是細(xì)菌分類和菌種鑒定的重要指標(biāo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，菌株TRM4064的(G+C)mol%是66.3%，當(dāng)前 Actinopolyspora屬已知有效命名種的(G+C)mol%范圍在66.0% ～69.0%之間。因此，菌株 TRM4064的(G+C)mol%與Actinopolyspora屬(G+C)mol%的范圍一致。

3 討論

多孢放線菌屬Actinopolyspora最早被Gochnauer等［14］在1975年首次分離得到，即嗜鹽多孢放線菌 Actinopolyspora halophila。當(dāng)前 Actinopolyspora共含有5個(gè)有效命名的物種，即Actinopolyspora halophila、Actinopolyspora mortivallis、Actinopolyspora xinjiangensis、Actinopolyspora alba 和Actinopolyspora erythraea均分離自高鹽環(huán)境。菌株TRM4064分離自高鹽的鹽湖環(huán)境，采用多相分類技術(shù)有效證明了該菌株為Actinopolyspora屬的新成員，這一發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步豐富Actinopolyspora屬的物種多樣性，從而為極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用提供新的材料支撐。另外，云南大學(xué)微生物所對新疆、青海等地的高鹽環(huán)境進(jìn)行了放線菌資源的系統(tǒng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了大量嗜鹽放線菌新物種［15］。這些極端環(huán)境中的嗜鹽放線菌是依賴于一種或多種極端物化因子的極端生命形式，它們構(gòu)成了地球生命形式的獨(dú)特風(fēng)景線，為更好地認(rèn)知生命現(xiàn)象、發(fā)展生物技術(shù)提供了寶貴的材料源泉。

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