單麗紅，喬 星，李 央，張璐珈，焦 凱，劉宏民

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450001;2.鄭州大學(xué)新藥研發(fā)中心，河南鄭州450001)

0 引言

甾體化合物廣泛分布于自然界及生物體內(nèi)，是一類(lèi)重要的生物活性分子，被譽(yù)為藥學(xué)領(lǐng)域的“Golden Egg”［1］.近年來(lái)，去氫表雄酮(Dihydroepiandrostrone，DHEA)及其在肝臟中的主要代謝產(chǎn)物7-羥基DHEA表現(xiàn)出非常好的生物活性，如提高試驗(yàn)動(dòng)物的免疫能力［2-3］，阻止體外神經(jīng)元缺氧細(xì)胞死亡［4］，并且對(duì)治療阿爾茨海默病和降低體重也有一定作用［5］.這些重要的研究成果引起了眾多學(xué)者對(duì)甾體7-羥基衍生物的研究興趣.

雖然甾體7位的羥基化用化學(xué)方法相對(duì)其它位置比較容易進(jìn)行，但是這些方法路線長(zhǎng)，所用試劑昂貴或有毒，不利于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn).利用微生物轉(zhuǎn)化法可以很好的克服化學(xué)合成法的不足，還具有高效、低耗、污染少等明顯優(yōu)勢(shì)，符合現(xiàn)代“綠色化學(xué)”的要求.

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在甾環(huán)16位引入芳亞甲基結(jié)構(gòu)，可使其產(chǎn)生細(xì)胞毒作用［6-7］.因此本課題組利用 Claison-Schimidt縮 合 反 應(yīng) 在 7α-羥 基DHEA的16位引入系列取代苯亞甲基基團(tuán)，合成得到8個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，并測(cè)試了這些化合物對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑:去氫表雄酮(99%，漢江振華生物科技有限公司);葡萄糖(分析純，汕頭市西隴化工廠)，蛋白胨和酵母膏(生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司);磷酸二氫鉀(分析純，汕頭金沙化工廠);瓊脂(Slandand International Inc);薄層層析和柱層析硅膠(化學(xué)純，青島海浪硅膠干燥劑廠)，所用工業(yè)溶劑均經(jīng)重蒸.儀器:WC-1型顯微熔點(diǎn)儀;BIO-RAD公司FTS-40型紅外分光光度計(jì)(KBr壓片);瑞士Bruker DPX-400型超導(dǎo)核磁共振儀;HZQ-Q全溫振蕩器;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋.菌種:卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus，自篩)，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC2256.斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30 g，蛋白胨12 g，酵母膏1.0 g，磷酸二氫鉀 0.9 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 4.5.

1.2 制備和表征

1.2.1 生物轉(zhuǎn)化

按照1.1節(jié)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成配置1 000 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至10個(gè)厄倫美厄燒瓶，高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻后在安全柜中接種，接種后的培養(yǎng)基放置恒溫振蕩器中，培養(yǎng)48 h(28℃，220 r/min)后，將1.0 g DHEA 溶解于10 mL丙酮后加入上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化4 d.轉(zhuǎn)化結(jié)束后，過(guò)濾除去菌絲體，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮后用飽和NaHCO3、飽和食鹽水及水各洗3次，無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸干溶劑，得到白色固體，柱層析(V乙酸乙酯:V石油醚=1∶3)分離得到化合物1和2，結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 卷枝毛霉轉(zhuǎn)化DHEAFig.1 Biotransformation of DHEA by Mucor circinelloides

化合物1:白色固體粉末，收率為31.56%;mp 179.3～181.2℃ (literature 181.5～183.5℃［8］); ［α］20D-71°(c.0.21，MeOH);IR(KBr)ν:3 431，2 933，1 730，1 657，1 621，1 375，1 057 cm-1;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ0.89(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，3.46(1H，m，H-3)，3.89(1H，t，H-7，2J=7.6 Hz)，5.57(1H，d，H-6，2J=5.2 Hz);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ:223.9，146.8，124.6，71.9，64.9，49.6，46.4，43.8，42.9，38.6，38.6，38.0，36.6，32.4，32.1，22.7，21.2，18.6，13.7;HR-MS m/z%:［M+H］+305.211 2(calcd.305.2117).

化合物2:白色固體粉末，收率為12.59%;mp 208.6～209.8℃ (literature 215～216℃［8］);［α］D20-93°(c.0.29，MeOH);IR(KBr)ν:3 364，2 930，1 730，1 660，1 629，1 380，1 056 cm-1;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ0.78(3H，s，H-18)，0.98(3H，s，H-19)，3.26(1H，m，H-3)，3.70(1H，d，H-7，2J=8.0 Hz)，5.18(1H，s，H-6);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ220.5，141.6，127.1，71.3，70.0，50.9，48.2，47.3，41.9，39.3，36.8，36.3，35.7，31.7，31.3，24.2，20.2，19.0，13.4;HR-MS m/z%:［M+H］+305.211 5(calcd.305.211 7).

1.2.2 3β，7α-二羥基-16-苯亞甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a-h的合成

圖2 化合物1a～h的合成Fig.2 Synthesis of compound 1a～h

化合物1 100 mg(0.33 mmol)溶于10～20 ml 95%乙醇，加入固體氫氧化鈉0.2～0.3 g，室溫?cái)嚢?0 min，加入苯甲醛(0.05 ml)或各種取代苯甲醛(0.4 mmol)，繼續(xù)室溫?cái)嚢?，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，減壓蒸干乙醇，加入20～30 mL乙酸乙酯使瓶?jī)?nèi)固體溶解，繼而用飽和食鹽水15 mL分三次洗滌，至有機(jī)相呈中性，再將有機(jī)相用水洗1-2次，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干乙酸乙酯，所得固體混合物可用柱層析(V乙酸乙酯:V氯仿=2:1)的方法分離純化.

化合物1a:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:187.3～188.2℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.55(2H，d，J=7.18 Hz)，7.37(2H，d，J=7.39 Hz)，7.35(1H，d，J=5.9 Hz)，7.26(1H，s)，5.65(1H，d，J=5.5 Hz)，4.06(1H，s)，3.57(1H，m)，1.05(3H，s)，0.98(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 210.4，147.4，136.6，136.6，134.0，131.2，131.2，130.0，129.3，129.4，124.4，71.9，65.2，47.6，43.9，43.5，42.7，38.3，37.5，37.6，32.0，31.9，30.1，20.9，19.0，14.8;HR-MS m/z%:［M+H］+393.241 6(calcd.393.242 9).

表1 化合物1a～h的結(jié)構(gòu)和收率Tab.1 Structure and yield of comp.1a～h

化合物1b:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:161.7～163.4℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 8.26(2H，d，J=8.36 Hz)，7.68(2H，d，J=8.36 Hz)，7.45(1H，s)，5.67(1H，d，J=4.56 Hz)，4.06(1H，s)，3.59(1H，m)，1.00(3H，s)，0.87(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3):δ 208.8，147.4，146.8，142.0，139.9，130.7，130.7，130.3，123.8，123.9，123.4，71.1，64.4，47.0，43.1，42.8，41.9，37.6，36.8，36.8，31.3，31.1，29.4，20.1，18.3，13.9;HR-MS m/z%:［M+H］+437.219 8(calcd.437.220 2).

化合物1c:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:172.5～173.6℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 8.39(1H，s)，8.21(1H，d，J=8.93 Hz)，7.83(1H，d，J=7.76 Hz)，7.59(1H，t，J=15.94 Hz)，7.46(1H，s)，5.67(1H，d，J=5.14 Hz)，4.08(1H，s)，3.59(1H，m)，1.07(3H，s)，1.01(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ 209.3，146.7，136.3，135.1，134.1，131.8，131.5，131.5，128.9，128.9，123.5，71.2，64.4，46.9，43.2，42.8，41.9，37.6，36.8，36.9，31.3，31.2，29.3，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+427.203 5(calcd.427.204 0).

化合物1d:淡黃色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:168.2 ～ 169.8℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3): δ 7.53(2H，d，J=8.50 Hz)，7.38(1H，s)，7.08(2H，t，J=17.2 Hz)，5.63(1H，d，J=5.03 Hz)，4.04(1H，s)，3.54(1H，m)，1.04(3H，s)，0.96(3H，s);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 209.6，164.3，161.8，146.6，135.4，132.3，132.2，132.0，123.5，115.9，115.7，71.1，64.4，46.9，43.2，42.8，41.9，37.6，36.9，36.9，31.2，31.2，29.2，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+411.233 6(calcd.411.233 5).

化合物1e:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:179.3 ～180.8℃;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)):δ 7.61(1H，s)，7.57(1H，d，J=7.72 Hz)，7.40(1H，m)，7.08(1H，d，J=8.2 Hz)，7.04(1H，t，J=14.96 Hz)，5.45(1H，d，J=5 Hz)，3.84(3H，s)，3.30(1H，m)，0.96(3H，s)，0.88(3H，s);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6): δ 208.8，158.4，144.0，136.5，131.2，129.6，126.1，124.4，123.8，120.6，111.5，69.9，62.7，55.8，46.6，43.3，42.3，42.1，37.1，36.7，31.5，31.4，28.9，19.9，18.1，13.9;HR-MS m/z%:［M+H］+422.2451(calcd.422.2457).

化合物1f:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:185.1～186.3℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.36(1H，s)，6.77(2H，s)，5.65(1H，d，J=4.84 Hz)，4.03(1H，s)，3.88(9H，s)，3.58(1H，s)，1.05(3H，s)，0.98(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3): δ 209.5，153.1，146.7，139.3，135.0，133.4，131.1，123.4，107.7，107.7，71.2，64.4，61.0，56.1，56.2，46.9，43.2，42.7，41.9，37.6，36.9，31.3，31.2，29.1，20.1，18.3，14.0;HR-MS m/z%:［M+H］+483.2740(calcd.483.2746).

化合物1g:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:174.2～176.1℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ 7.668(1H，d，J=7.61 Hz)，7.51(1H，s)，7.43(1H，t，J=7.90 Hz)，7.108(1H，d，J=8.41 Hz)，7.01(1H，d，J=7.48 Hz)，5.45(1H，d，J=5.40)，3.60(1H，d，H-7，J=2.58 Hz)，3.33(1H，m，H-3)，2.86(1H，t，H-17，J=8.7 Hz)，1.05(1H，s，H-19)，0.97(1H，s，H-18);13C NMR(100M Hz，CDCl3): δ 208.4，157.7，145.1，135.5，131.2，128.9，126.0，124.7，122.3，120.2，111.7，69.0，62.5，56.8，46.2，43.0，42.5，42.1，37.3，36.5，36.0，33.5，31.4，28.6，19.7，18.3，13.5;HR-MS m/z%:［M+H］+422.245 5(calcd.422.2457).

化合物1h:白色固體粉末，收率見(jiàn)表1，mp:180.1 ～182.4℃;1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ7.67(1H，s)，7.53(1H，d，J=7.72 Hz)，7.38(1H，m)，7.02(1H，d，J=8.1 Hz)，7.04(1H，t，J=14.90 Hz)，5.45(1H，d，J=5.2 Hz)，3.78(3H，s)，3.35(1H，m)，1.04(3H，s)，0.86(3H，s);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ 208.8，159.2，143.7，144.0，135.6，128.9，127.8，125.1，120.8，114.7，71.6，65.3，53.1，56.2，51.0，42，3，41.7，39.8，38.0，37.2，34.1，31.3，25.9，20.6，19.3，19.0;HR-MS m/z%:［M+H］+408.229 7(calcd.408.230 1).

1.2.3 3β，7α-二羥基-16-苯亞甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的細(xì)胞毒活性研究

采用MTT法，考察了化合物1a～h對(duì)人食管癌上皮細(xì)胞株EC109的抑制活性.結(jié)果如表2所示.考慮到化合物1a～h的結(jié)構(gòu)中均形成了α，β不飽和酮的結(jié)構(gòu)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從中藥冬凌草中提取的冬凌草甲素(Oridonin，圖3)普遍用于治療消化道腫瘤，其抗腫瘤活性中心就是結(jié)構(gòu)中的α-環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮單元［9］，因此我們選擇冬凌草甲素作為陽(yáng)性對(duì)照品.

圖3 Oridonin的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of Oridonin

表2 化合物1a～h對(duì) EC109細(xì)胞株的抑制率(50 μg/mL)Tab.2 Inhibition rate of EC109 cells by comp.1a～h

2 結(jié)果與討論

2.1 生物轉(zhuǎn)化

從卷枝毛霉轉(zhuǎn)化DHEA的發(fā)酵液中經(jīng)柱層析分離得到兩個(gè)純的化合物1、2，經(jīng)IR、NMR及HRMS等多種方法確證，并與文獻(xiàn)［8］對(duì)照，分別確定為DHEA 的7α-和7β-羥基衍生物.其中7α-羥基DHEA的收率(31.56%)較7β-羥基 DHEA(12.59%)為高，是主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物.

2.2 3β，7α-二羥基-16-苯亞甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的合成

以7α-羥基 DHEA(1)為原料，利用 Claison-Schimidt縮合反應(yīng)，使其分別與苯甲醛及多種取代苯甲醛進(jìn)行反應(yīng)，在其16位引入系列取代苯亞甲基基團(tuán)，共得到8種衍生物1a～h，均為未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物.以化合物1a為例，在1H NMR譜中，7.26處出現(xiàn)一個(gè)單峰，判斷為芐位氫的信號(hào)，同時(shí)在δ 7.55-7.35處也出現(xiàn)了單取代苯的質(zhì)子信號(hào).13C NMR譜中苯環(huán)碳的信號(hào)則為147.4(C-1’)，126.6(C-2’，6’)，131.2(C-3’，5’)，134.0(C-4’).由以上分析可以判斷1a的結(jié)構(gòu)為3β，7α-二羥基-16-苯亞甲基雄甾-5-烯-17-酮.

2.3 3β，7α-二羥基-16-苯亞甲基雄甾-5-烯-17-酮衍生物1a～h的細(xì)胞毒活性研究

甾體化合物在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用已得到廣泛證實(shí)［10］，因此，筆者對(duì)所合成的甾體化合物進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性篩選.表2列出了化合物1a-h對(duì)人食管癌上皮細(xì)胞株EC109的抑制活性.從表中所顯示的結(jié)果可以看出經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后得到的羥基化衍生物1、2的抑制活性相應(yīng)比其原料DHEA有所提高，說(shuō)明引入羥基可增強(qiáng)其抗腫瘤作用.而以1為母體進(jìn)行改造的苯亞甲基衍生物1a～h均比其母體化合物1的活性有明顯提高.這說(shuō)明在甾體結(jié)構(gòu)中引入苯亞甲基結(jié)構(gòu)可顯著增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性，而且這種體外抑制活性和苯環(huán)上的取代基也有一定關(guān)系，吸電子基團(tuán)比斥電子基團(tuán)的活性好，但與取代基的位置關(guān)系不大.

3 結(jié)論

筆者利用卷枝毛霉對(duì)去氫表雄酮進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究，從發(fā)酵液中分離得到其7α-和7β-羥基化產(chǎn)物，并利用Claison-Schimidt縮合反應(yīng)在7α-羥基去氫表雄酮的16位引入帶有不同取代基的苯亞甲基結(jié)構(gòu)，得到8個(gè)新化合物，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明引入苯亞甲基結(jié)構(gòu)的衍生物對(duì)人食管癌上皮細(xì)胞株EC109有較強(qiáng)的抑制活性.

［1］ALEXANDER K，ZDENA K，MILO? B.Neurosteroids:7-aza-allopregnanolone-a poor substitute for allopregnanolone［J］.Tetrahedron，2007，63:11355-11362.

［2］MORFIN R，COURCHAY G.Pregnenolone and dehydroepiandrosterone as precursors of native 7-hydroxylated metabolites which increase the immune response in mice［J］.J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，1994，50(1-2):91-100.

［3］CAROLINA G L，MARIA E S，VALERIA S，et al.Effects of dehydroepiandrosterone on ovarian cystogenesis and immune function［J］.Journal of Reproductive Immunology，2004，64(1-2):59-66.

［4］DANENBERG H D，BEN-YEHUDA A，ZAKAYRONES Z，et al.Dehydroepiandrosterone(DHEA)treatment reverses the impaired immune response of old mice to influenza vaccination and protects from influenza infection［J］.Vaccine，l995，13:1445-1448.

［5］BAULIEU E E，ROBEL P，F(xiàn)ELLOUS A，et al.MAPREG:Toward a novel approach of neuroprotection and treatment of Alzheimer's disease［J］.J.Mol.Neurosci.，2004，24(1):63-65.

［6］CHATTOPADHAYA R，JINDAL D P，MINU M，et al.Synthesis and cytotoxic studies of Hydroximino derivatives of some 16E-arylidenosteroids［J］.Arzneimittel Forschung，2004，54(9):551-556.

［7］DUBEY S，PIPLANI P，JINDAL D P.Synthesis and evaluation of some 16-benzylidene substituted 3，17-dioximino androstene derivatives as anticancer agents［J］.Letters in Drug Design ＆ Discovery，2005，2(7):537-545.

［8］CRABB T A，DAWSON P J，WILLIAMS R O.Microbio-logical transformations.Part3.The oxidation of androstene derivatives with the fungus Cunninghamella Elegans［J］.J.Chem.Soc.Perkin，1980，11:2535-2541.

［9］FUJITA E，NAGAO Y，KOHNO T，et al.Antitumor activity of acylated oridonin［J］.Chem.Pharm.Bull.，1981，29(11):3208-3213.

［10］VOGEL C L.Update on the current use of hormonals as therapy in advanced breast cancer［J］.Anticancer Drugs，2003，14(4):265-273.