倪偉民 房 艷 衣服新 邱建武 叢 明 王 冰

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121000)

最新研究表明，引起腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移生長的細(xì)胞只占全部腫瘤細(xì)胞的很小部分，稱之為腫瘤干細(xì)胞(TSC)。近年來國內(nèi)外學(xué)者相繼從腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞株中成功分離出腦膠質(zhì)瘤TSC〔1〕(BTSC)，其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中均起著決定性作用。研究表明Notch信號通路〔2〕在正常干細(xì)胞和TSC的自我更新、增殖及分化過程中起主要的調(diào)控作用，該通路的關(guān)鍵蛋白在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中表達(dá)異常。氮-〔氮-(3，5-二氟苯乙酰)-L-丙氨?！?S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，是目前公認(rèn)為Notch信號通路的阻斷劑。但DAPT在抗腫瘤方面的研究尚少，本文擬分析DAPT對SHG-44細(xì)胞增殖的抑制情況及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑和儀器 人膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。L-DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，總RNA提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，RT-PCR一步法試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DAPT購自瑞士ALEXIS公司，碘化丙啶(PI)、MTT購自美國Amersco公司?？筃otchl、抗Deltal、抗Hes1購自美國Chemicon公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，凝膠成像系統(tǒng)為北京Tanon公司產(chǎn)品，PCR儀為美國MJ Research公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇SHG-44細(xì)胞，L-DMEM培養(yǎng)液(10%FBS)、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液，達(dá)90%融合時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 將SHG-44細(xì)胞隨機(jī)分5組，分別應(yīng)用不同濃 度 的 DAPT，A 組:0 μmol/L;B 組:0.5 μmol/L;C 組:1.0 μmol/L;D 組:5.0 μmol/L;E 組:10.0 μmol/L。L-DMEM(10%FBS)，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液。

1.2.3 MTT法檢測DAPT對SHG-44細(xì)胞增殖的影響 取傳代培養(yǎng)的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化，以1×104ml－1的細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，按上述5組的濃度加入DAPT，于5 d內(nèi)的每 24 h取出一板，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫儀選擇570 nm波長測定各孔的光吸收值(OD值)，繪制各組細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集上述5組不同濃度DAPT處理的SHG-44細(xì)胞48 h后，0.25%胰酶消化，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106ml－1，4℃ 1 000 r/min離心5 min，細(xì)胞沉淀加入預(yù)冷的70%乙醇輕輕吹打懸浮，4℃固定過夜。次日固定后的細(xì)胞800 r/min離心5 min，加500 μl的PI染液(0.05‰ PI，0.02‰ Rnase)吹打懸浮，4℃避光靜置染色30 min，上機(jī)檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133+的細(xì)胞比例 應(yīng)用上述5組濃度DAPT處理SHG-44細(xì)胞48 h后，胰酶消化，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106ml－1。4℃ 1 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞重懸并移入 EP管(100 μl/管)，每管加入 FITC標(biāo)記的CD133抗體10 μl，以不加抗體作為陰性對照，避光孵育30 min，PBS洗滌以去除未結(jié)合的抗體，4℃ 1 000 r/min離心5 min，加500 μl PBS，上機(jī)檢測。

1.2.6 RT-PCR 檢測 Notch-1，Delta-l，Hes-1 mRNA 的表達(dá)DAPT處理SHG-44細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞，每2×106個細(xì)胞加入1 ml Trizol，消化細(xì)胞提取總RNA，用核酸蛋白定量儀測定RNA濃度與純度。應(yīng)用Takara的RT-PCR試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進(jìn)行:52℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，合成cDNA，PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，并利用圖像分析軟件Gene Tools分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增引物與退火溫度見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western印跡法檢測Notch-1，Delta-l，Hes-1蛋白的表達(dá)

DAPT處理SHG-44細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，充分混合沉淀加上樣緩沖液，SDS-PAGE變性凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜印跡，封閉，兔抗人Notch-1(1∶1 000)，Delta-l(1∶800)，Hes-1(1∶1 000)一抗孵育，4℃靜置過夜，洗滌，結(jié)合HRP標(biāo)記的二抗，洗滌，HRP-ECL發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)觀察 經(jīng)DAPT處理48 h后SHG-44細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)和數(shù)量變化:A組細(xì)胞數(shù)目多，梭形細(xì)胞為主，不規(guī)則細(xì)胞比例較低，細(xì)胞間黏附完好，密集排列于培養(yǎng)板底。B組細(xì)胞數(shù)目較A組稍有減少，形態(tài)變化不明顯;C組經(jīng)1.0 μmol/L DAPT處理的SHG-44細(xì)胞數(shù)目明顯減少，不規(guī)則及大體積細(xì)胞比例增多，細(xì)胞稀疏分布于培養(yǎng)瓶底。D、E組細(xì)胞數(shù)目減少更加明顯，可見細(xì)胞壞死崩解，殘存細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整，不易貼壁而懸浮于培養(yǎng)液中。見圖1。

圖1 各組SHG-44細(xì)胞的形態(tài)變化(相差顯微鏡，×100)

2.2 MTT檢測結(jié)果 與A組比較，B、C、D、E組的SHG-44細(xì)胞增殖均受到DAPT的抑制，其中B組與A組比較具有明顯差異(P＜0.05)，但B組增殖程度明顯高于C、D、E組(P＜0.05)。表明隨著DAPT濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，但C、D、E組無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以明顯抑制SHG-44細(xì)胞增殖，并具有DAPT濃度依賴性，而C組的抑制效果已比較顯著，且與更高濃度組無顯著差異，可以成為首選治療濃度(圖2)。

圖2 各組SHG-44細(xì)胞的增殖曲線

2.3 DAPT對SHG-44細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B、C、D、E各組的SHG-44細(xì)胞經(jīng)DAPT作用48 h后，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P＜0.05)，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。B組各期細(xì)胞比例的變化明顯低于C、D、E組(P＜0.05)，而C、D、E組之間無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以使SHG-44細(xì)胞聚集于G1/G0期，降低S期細(xì)胞比例，C組即可達(dá)到明顯的抑制作用(表2)。

表2 各組SHG-44細(xì)胞各期細(xì)胞的百分比(±s，n=20，%)

表2 各組SHG-44細(xì)胞各期細(xì)胞的百分比(±s，n=20，%)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

分組 G0/G1 S G2/M A組56.25±1.31 28.47±1.24 15.38±0.87 B組 61.97±5.801) 23.89±4.421) 15.25±3.61 C組 67.19±4.721)2) 18.57±2.301)2) 14.05±1.53 D組 68.73±7.681) 18.45±2.201) 13.82±1.36 E組 70.58±9.441) 16.39±3.351)13.03±3.41

2.4 CD133+的TSC比例 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，B、C、D、E組的SHG-44細(xì)胞經(jīng)DAPT作用48 h后，CD133+細(xì)胞比例明顯下降，表達(dá)量分別是 A組為(25.75±2.13)%，B組為(19.57±3.04)%，C組為(15.91±2.98)%，D組為(10.15±2.33)%，E 組為(7.02±3.17)%。與 A 組比較，B、C、D、E 組均明顯下調(diào)了CD133+細(xì)胞比例(P＜0.05);而隨藥物濃度增加CD133+細(xì)胞比例下降越明顯(F=66.12，P=0.002)。表明DAPT使SHG-44細(xì)胞中CD133+的TSC比例明顯下降，具有明顯劑量依賴性。

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果 Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1表達(dá)水平的變化趨勢基本一致。與A組比較，4組經(jīng)DAPT處理的細(xì)胞這3種基因表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。而B組的表達(dá)水平明顯高于 C、D、E組(P＜0.05)，但C、D、E組之間表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。表明DAPT可以下調(diào)SHG-44細(xì)胞中Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的表達(dá)水平，C組效果與D、E高濃度組無明顯差異，可以作為藥物濃度的最佳選擇(圖3)。

圖3 各組SHG-44細(xì)胞后的基因表達(dá)

2.6 Western印跡結(jié)果 與A組比較，B、C、D、E組的3種蛋白表達(dá)水平明顯減弱(P＜0.05)。而B組的表達(dá)水平明顯高于C、D、E 組(P＜0.05)，C、D、E 組之間表達(dá)水平無明顯差異(P ＞0.05)。表明DAPT可以下調(diào)SHG-44細(xì)胞中Notch信號通路上游基因Notch-1、Delta-1和靶基因Hes-1的蛋白表達(dá)，C組下調(diào)效果與D、E高濃度組無明顯差異(圖4)。

圖4 各組SHG-44細(xì)胞后的蛋白表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率都很高，病程難以控制。其傳統(tǒng)的化療藥物主要針對高度增殖的腫瘤細(xì)胞，最大限度地清除或殺滅腫瘤組織和細(xì)胞。TSC的存在是導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化學(xué)耐藥等的根本問題。Notch信號通路在干細(xì)胞和TSC的增殖分化中起重要作用，并發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在多種腫瘤中異常活化〔3〕。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體和CSL(一種DNA結(jié)合蛋白)三部分組成，配體與受體結(jié)合后，Notch受體相繼發(fā)生兩次蛋白水解。第二次是由γ-分泌酶(γ-secretase，又稱早老蛋白presenilin，PS)在跨膜區(qū)靠近胞膜內(nèi)的位點(diǎn)切割蛋白，使具有核定位信號的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(NICD)釋放入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合蛋白CSL相互作用，導(dǎo)致下游的Hes、Hey、HERP、bHLH基因激活，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡〔4〕。γ-分泌酶是Notch信號激活過程中的關(guān)鍵酶〔5〕。應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑可以阻斷Notch信號通路中NICD的產(chǎn)生，從而抑制NICD引發(fā)的細(xì)胞分化、增殖和凋亡的異常。另外γ-分泌酶抑制劑還能干擾腫瘤細(xì)胞與脈管上皮細(xì)胞之間的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制腫瘤中血管的生成。DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，被公認(rèn)為Notch信號通路的有效阻斷劑，經(jīng)證明在抗腫瘤方面具有潛在作用〔6〕。

本實驗提示1.0 μmol/L DAPT可成為臨床治療的有效濃度。有研究〔7〕檢測了6種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和原發(fā)性人腦膠質(zhì)瘤中Notch-1及其配體Delta-1、Jagged-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果三者均呈過度表達(dá)，另外，免疫組化染色顯示絕大多數(shù)Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中Notch-1蛋白有中到高水平表達(dá)。本實驗結(jié)果提示腫瘤的惡性程度與Notch的活化相關(guān)。結(jié)合MTT和細(xì)胞周期檢測結(jié)果，DAPT對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44的增殖抑制作用有可能與Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下調(diào)有關(guān)。Hes-1蛋白還能通過抑制Cyclin依賴性激酶抑制因子p27的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)細(xì)胞增殖〔8〕，下調(diào)Hes-1的表達(dá)則起到抑制細(xì)胞增殖的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)DAPT可使SHG-44細(xì)胞系中CD133+比例明顯下降，降為原來的四分之一左右。Fan等〔9〕發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的BTSC中，阻斷Notch信號，CD133表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量降為原來的五分之一。與本實驗結(jié)果基本一致。CD133+被認(rèn)為是BTSS的特征性標(biāo)記，CD133+細(xì)胞表達(dá)比例下降提示SHG-44細(xì)胞系中TSC明顯減少。抑制Notch通路可明顯抑制TSC的增殖，其下降機(jī)制也可能與Notch-1，Delta-1，Hes-1 mRNA的下調(diào)有關(guān)。同時TSC的減少也是抑制腫瘤增殖的重要手段，可能為惡性腫瘤的根治提供幫助。

綜上，DAPT可通過阻斷Notch信號通路抑制SHG-44細(xì)胞的增殖，1.0 μmol/L的藥物濃度即可達(dá)到明顯的作用效果，DAPT細(xì)胞毒性低，副作用少;DAPT可以明顯抑制TSC增殖。

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