李 茜 高 峰 楊學(xué)文

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合重點實驗室，江蘇南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210029

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期發(fā)病迅速，病程持續(xù)，關(guān)節(jié)僵硬腫痛，甚至生活不能自理，給患者造成極大的痛苦。目前臨床治療方案多以大量使用激素及免疫抑制劑為主，這種方案主要有兩大問題：一是具有不可忽視的副作用；二是對一些不適宜使用激素或免疫抑制劑的患者無從下手。因而近年來中醫(yī)藥治療RA的作用越來越引起關(guān)注，從瘀熱的病理角度治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎得到普遍認(rèn)同[1]。本研究測定大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型形成以及應(yīng)用犀角地黃湯治療過程中的表達(dá)水平，目的在于進(jìn)一步探討犀角地黃湯治療RA急性期的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

6～8 周齡雄性 SD 大鼠 45 只，體重（150±10）g，購于上海斯萊克實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑

犀角地黃湯（犀角、生地黃、芍藥、丹皮、虎杖、地龍）由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科配制。雞Ⅱ型膠原蛋白、完全福氏佐劑購自美國Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA marker、Taq DNA聚合酶試劑盒購自大連TaKaRa公司；引物、探針委托Invitrogen公司合成：根據(jù)文獻(xiàn)[2]合成PLC-γ1（Forwards：5'-GTCGACCTCATCAGCTACTA-3'；Reverses：5'-GGCTGTTCTCATCCAGATGC-3'） ，采用看家基因磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）（Forwards：5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'；Reverses：5'-AGATCCACAACGGATACATT-3）作為內(nèi)對照。

1.3 儀器

Eppen-dorf Centrifuge 5417R高速冷凍離心機、Biophotome-ter紫外可見分光光度計為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；ABI7500實時熒光PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為日本Kodak公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 大鼠分組及CIA模型構(gòu)建

2.1.1 分組 將6～8周齡雄性SD大鼠45只， 于清潔環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，應(yīng)用隨機方法分為3組，即空白對照組，CIA模型組，犀角地黃湯實驗組，每組15只。給各組大鼠稱重，其周齡、體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

2.1.2 CIA 模型構(gòu)建 配置Ⅱ型膠原（CⅡ）乳劑：將 CⅡ溶于0.01 mol/L冰醋酸中，攪拌使其充分溶解，配置濃度為2 g/L并4℃過夜后，與同等體積的完全福氏佐劑在冰浴中充分?jǐn)嚢杌旌希蛊淙榛瞥蒀Ⅱ乳劑，最終配置濃度為1 g/L。將CⅡ乳劑以0.007 mL/g的劑量在模型組、實驗組大鼠的背部、尾根及足底部進(jìn)行多點皮內(nèi)注射，1周后重復(fù)注射1次加強免疫。空白對照組：將生理鹽水按照與CⅡ乳劑的相同劑量及部位對大鼠進(jìn)行多點皮內(nèi)注射。1周后同樣注射1次[3]。

2.2 動物模型的給藥

實驗組灌胃給予犀角地黃湯，根據(jù)體表面積公式換算大鼠與人的等效劑量后（200 g大鼠的給藥劑量=70 kg 人的給藥劑量×0.018），按 0.025 g/kg 體重給藥?？瞻讓φ战M及模型組均以蒸餾水0.5 mL/d灌胃，每日1次，治療6周。

2.3 模型及治療評價

觀察各組大鼠的癥狀及治療過程，使用容積法測量大鼠后肢的腫脹度：用帶刻度的10 mL小試管裝水，固定大鼠，以脛骨下端內(nèi)躁處為解剖標(biāo)志點標(biāo)記，將待測后肢（包括整個足掌）深入液面下，使液面達(dá)標(biāo)記處，觀察并記錄水面上升數(shù)值。致炎后每5天測量1次，記錄容積，計算其關(guān)節(jié)腫脹度。腫脹度（%）=（Vt-V0）/V0×100%，其中，V0為造模前容積；Vt為造模后容積。結(jié)合病理切片評價模型建立是否成功以及藥物療效。

2.4 標(biāo)本制備

在模型給藥后第42天將各組動物統(tǒng)一處死，取大鼠足踝關(guān)節(jié)滑膜組織，用無菌生理鹽水清洗后快速放入1%DEPC水處理過的凍存管中，入液氮保存。充分研碎冷凍組織后，置于加入1 mL Trizol的離心管中裂解，經(jīng)過氯仿萃取、異丙醇沉淀、含7.5%DEPC乙醇洗滌過程后，將抽提出的RNA中加入30 μL DEPC水進(jìn)行溶解，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。計算RNA的濃度并取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)公式總 RNA（μg/mL）=A260×稀釋倍數(shù)×40 μg/mL。 逆轉(zhuǎn)錄采用二步法：①在0.2 mL離心管中加入模板總RNA 2 μg，50 pmol/μL oligo（dT）1 μL，補 DEPC 水至管內(nèi)液體總體積達(dá)12 μL；加熱70℃ 5 min后冰上急冷5 min。②再加入400 U/μL RNAseinhibitor 200 U、10 mmol/L dNTP 1 μL、200 U/μL M-MLV 酶 1 μL、5×buffer 4 μL，補 DEPC 水至管內(nèi)液體總體積達(dá) 20 μL。設(shè)定反應(yīng)條件 42℃ 60 min、85℃ 5 min將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA放置于-20℃保存。

2.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR檢測大鼠PLC-γ1 mRNA參照文獻(xiàn)[3]的反應(yīng)條件，在ABI 7500實時熒光PCR儀上進(jìn)行。讀出PLC-γ1 mRNA與GAPDH拷貝數(shù)，將PLC-γ1 mRNA的拷貝數(shù)除以相應(yīng)標(biāo)本GAPDH的拷貝數(shù)，從而得到PLC-γ1 mRNA相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型及治療評價

大鼠足-踝關(guān)節(jié)腫脹度的測定結(jié)果：模型組足-踝關(guān)節(jié)腫脹度明顯大于空白對照組（P＜0.01），實驗組足-踝關(guān)節(jié)腫脹度小于模型組（P＜0.05）。見表1。病理切片顯示：空白對照組關(guān)節(jié)腔滑膜組織未見炎性反應(yīng)（圖1）；模型組關(guān)節(jié)腔滑膜組織可見炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織填充（圖2）；實驗組關(guān)節(jié)腔滑膜組織增生，有輕度充血（圖3）。結(jié)合以上實驗結(jié)果證明：大鼠關(guān)節(jié)炎模型造模成功，并證實犀角地黃湯對大鼠關(guān)節(jié)腫脹有抑制作用。

表1 不同時期各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的變化（%，±s）

表1 不同時期各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的變化（%，±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

空白對照組模型組實驗組15 15 15 0 31.73±1.81*29.76±1.56 0 28.31±1.43*24.77±1.29△0 27.66±1.27*21.75±1.16△0 27.14±1.36*18.74±0.12△組別 只數(shù) 10 d 20 d 30 d 40 d

圖1 空白對照組（HE染色，400×）

圖2 模型組（HE染色，400×）

圖3 實驗組（HE染色，400×）

3.2 PLC-γ1在各組大鼠關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)情況

關(guān)節(jié)滑膜組織PLC-γ1表達(dá)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.711，P<0.01）。模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中PLC-γ1的相對表達(dá)量明顯高于空白對照組（P<0.01），實驗組PLC-γ1的相對表達(dá)量低于模型組（P<0.05）。 見表 2。

4 討論

PLC是參與調(diào)控細(xì)胞的增值分化等細(xì)胞代謝活動的重要物質(zhì)之一，通常分為 PLC-β、PLC-γ、PLC-ε 和PLC-δ四大類型，其中每一類型還有亞型，如 PLC-γ分為PLC-γ1和 PLC-γ2兩個亞型。PLC-γ1在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而 PLC-γ2主要表達(dá)于造血干細(xì)胞[4]，其結(jié)構(gòu)中含有水解磷酸酰肌醇二磷酸（PIP2）所必需的結(jié)構(gòu)域。它將PIP2水解，產(chǎn)生了二酸基甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）這兩種第二信使。DAG能夠激活蛋白激酶C（PKC），并通過這一途徑參與調(diào)控許多細(xì)胞活動，特別是細(xì)胞分化和增殖。IP3能夠引起細(xì)胞內(nèi)“鈣庫”中鈣離子（Ca2+）的釋放，激活鈣調(diào)蛋白（CAM）系統(tǒng)，并通過這一途徑使得細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)[5]。Wells等[6]應(yīng)用成纖維細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞、軟組織上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞驗證了PLC-γ1為生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞活動增加所必需。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）也正是通過與絡(luò)氨酸激酶（PTK）結(jié)合后激活PLC，并通過這一途徑參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化的，從而誘導(dǎo)血管滲透性，這與血管新生和炎性反應(yīng)相關(guān)[7]。

表2 PLC-γ1在各組大鼠關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)情況（±s）

表2 PLC-γ1在各組大鼠關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)情況（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

組別 只數(shù) PLC-γ1相對表達(dá)量空白對照組模型組實驗組15 15 15 0.031±0.001 0.125±0.001*0.072±0.001*△

RA的病因至今仍不清楚，但它有可能和一些病原體的感染有關(guān)，有研究報道，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀之前有腸炎沙門菌、腸耶爾森菌、空腸彎曲菌、沙眼衣原體和肺炎衣原體等病原體的感染。這些病原微生物的感染有可能通過小分子非肽抗原、熱休克蛋白（HSP）等途徑激活T細(xì)胞，使其發(fā)揮細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致靶細(xì)胞的損傷和破壞[8]。目前普遍認(rèn)為RA的病理機制是以T細(xì)胞為主的多種輔助因子作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)。有實驗表明，PLC-γ1能夠在細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域鎖定LT細(xì)胞位點，并與其他信號分子協(xié)同累積LAT、GrbZ和PLC等活化 T細(xì)胞，證明PLC-γ1的生物學(xué)功能在免疫系統(tǒng)中起了重要作用[9]。RA的主要的病理學(xué)特征是滑膜的持續(xù)性增生、大量炎癥細(xì)胞浸潤、軟骨及骨質(zhì)的破壞，這與病變滑膜組織中成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的增殖、分化和遷移有關(guān)。例如，Smith等[10]通過顯微注射刺激PLC-γ的SH2和SH3結(jié)構(gòu)區(qū)域，能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長并調(diào)控細(xì)胞周期。Bela等[11]認(rèn)為，目前至少有兩種途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，PLc-γ是通過與細(xì)胞內(nèi)的PTK受體結(jié)合，使與受體結(jié)合的效應(yīng)器活化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。另外，Kassis等[12]應(yīng)用PLC抑制劑U73122可使體外表皮生長因子（EGF）誘導(dǎo)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（LoVo）細(xì)胞的活動性明顯降低，并抑制其遷移。

綜上所述，運用犀角地黃湯治療RA急性期有效緩解患者癥狀的作用機制可能在于它可以降低促使與血管新生及組織細(xì)胞增生、遷移相關(guān)的VEGF、VEGFR2[13]、PLC-γ1的表達(dá)，可以對臨床用藥提供一定的實驗參考。

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