劉 艷，高宇平，呂吉元，李學(xué)文，王麗霞，陰艷萍

大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證明，β受體阻滯劑可改善心肌梗死患者的預(yù)后，降低病死率［1］。卡維地洛是一種非特異性腎上腺素能受體阻滯劑，可阻滯β1－受體、β2－受體、α1－受體，是一種強(qiáng)效氧自由基清除劑［2］，除具有阻斷交感神經(jīng)能活性作用外，其特有的抗氧化、抗增殖、抗凋亡作用能夠產(chǎn)生更完全的心肌保護(hù)作用［3］。長(zhǎng)時(shí)間激動(dòng)β1－受體、β2－受體對(duì)心肌細(xì)胞將產(chǎn)生不同影響：β1－受體誘導(dǎo)細(xì)胞肥大和凋亡，β2－受體則促使細(xì)胞存活［4］；即理論上長(zhǎng)時(shí)間對(duì)β2－受體阻滯有抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌重塑的不利作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究β2－受體激動(dòng)劑（特布他林）聯(lián)合卡維地洛的抗氧化、抗凋亡作用，及其對(duì)心肌梗死的影響，從而推斷其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，體重250g～300g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．2 主要藥品、試劑 卡維地洛片（齊魯制藥有限公司），特布他林片（無(wú)錫阿斯利康制藥有限公司）。谷胱甘肽試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Pieree公司）。β－actin抗體（Sanla Cruz）。

1．1．3 主要儀器 HX－100E型小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）。AE33型超聲儀（飛利浦公司）。臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭儀器廠）。電泳儀和電泳槽（北京六一儀器廠）。轉(zhuǎn)膜儀（Bio－RADCo．LTD）。

1．2 方法

1．2．1 模型制備 SD大鼠10%水合氯醛（300mg／kg），腹腔注射麻醉。連接心電圖，氣管內(nèi)插管，連接至動(dòng)物呼吸機(jī)。在胸骨左緣3、4肋間切開約2cm，剝離心包膜，暴露心臟，以7／0雙針縫線在左心耳下緣約2mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制成心梗模型［5］。假手術(shù)組于心臟相同部位穿線但不結(jié)扎。

1．2．2 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)取模型大鼠38只，隨機(jī)分為安慰劑組（n＝10）、卡維地洛組（n＝10）、聯(lián)合治療組（n＝10）。另設(shè)假手術(shù)組（n＝8）作為對(duì)照組。手術(shù)1周后開始以灌胃方式給藥，卡維地洛組給予卡維地洛生理水溶液8mg／kg，一日兩次。聯(lián)合治療組給予卡維地洛生理水溶液8mg／kg，特布他林生理水溶液2mg／kg，一日兩次。安慰劑組及假手術(shù)組均按體重給予適量生理鹽水，一日兩次。

1．2．3 檢測(cè)指標(biāo) ①超聲心動(dòng)圖，干預(yù)8周后行超聲心動(dòng)圖檢查。探頭（頻率10MHz）在二維超聲引導(dǎo)下取左室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）。②血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。大鼠稱重，麻醉，導(dǎo)管內(nèi)充滿肝素，右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，另一端連接壓力換能器多導(dǎo)生物信號(hào)記錄儀，記錄左室收縮壓（LVSP），左室舒張末壓（LVEDP），左室峰壓上升、下降最大速率（±dp／dt），心率（HR），外周平均動(dòng)脈壓（MBP）。③心肌組織中還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）測(cè)定：有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，處死大鼠，取適量左室心肌組織，保存于－70℃冰箱。用GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒計(jì)算總GSH及GSSG的含量［6］。④心肌組織中bcl－2蛋白質(zhì)表達(dá)：取保存于－70℃冰箱，用 Westem blot法描計(jì)，用photoshop7．0軟件計(jì)算bcl－2蛋白質(zhì)表達(dá)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17．0處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2．1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 安慰劑組LVEDd、LVESd明顯大于假手術(shù)組（P＜0．05），EF、FS則明顯低于假手術(shù)組（P＜0．05）。藥物治療組較安慰劑組LVEDd、LVESd縮?。≒＜0．05），EF、FS提高（P＜0．05）。聯(lián)合治療組較卡維地洛組LVEDd、LVESd更?。≒＜0．05），EF、FS更高（P＜0．05）。詳見表1。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05；與安慰劑組比較，2）P＜0．05；與卡維地洛組比較，3）P＜0．05

組別 n LVEDd（mm） LVESd（mm） EF（%） FS（%）假手術(shù)組8 4．68±0．15 3．16±0．23 77．00±6．67 46．00±7．35安慰劑組 10 7．63±0．561） 4．93±0．391） 41．75±5．251） 20．75±2．221）卡維地洛組 10 6．33±0．351）2） 4．33±0．141）2） 56．67±3．221）2） 26．33±2．081）2）聯(lián)合治療組 10 5．07±0．551）2）3） 3．37±0．392）2）3） 67．67±4．161）2）3） 35．67±4．041）2）3）

2．2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 安慰劑組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)較假手術(shù)組明顯惡化（P＜0．01）；藥物干預(yù)組較安慰劑組平均動(dòng)脈壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，心功能指標(biāo)改善（P＜0．05）；聯(lián)合治療組較卡維地洛組心功能指標(biāo)進(jìn)一步改善（P＜0．05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05；與安慰劑組比較，2）P＜0．05；與卡維地洛組比較，3）P＜0．05

組別 n HR（次／min） MBP（mmHg） LVSP（mmHg） LVEDP（mmHg） ＋dp／dt（mmHg／s） －dp／dt（mmHg／s）假手術(shù)組 8 355．00±13．53 103．67±7．09 135．67±5．86 8．07±4．54 3 214．67±33．95 1578．00±66．78安慰劑組 10 299．00±5．071） 85．00±4．581） 112．67±3．061） 20．11±0．401） 2 223．67±29．261） 1066．33±49．661）卡維地洛組 10 310．33±10．601） 89．67±1．531） 123．33±2．521）2） 18．15±0．161）2） 2 488．67±37．011）2）1 358．33±37．811）2）聯(lián)合治療組 10 340．00±13．232）3） 90．67±5．131） 133．33±3．062）3） 14．25±1．011）2）3）2 570．67±22．681）2）3）1 515．33±25．322）3）

2．3 心肌組織中 GSH、GSSG及凋亡蛋白（bcl－2）測(cè)定 安慰劑組較假手術(shù)組GSH明顯減少，GSSG明顯增加（P＜0．01），藥物治療組較安慰劑組GSH明顯增加，GSSG明顯減少（P＜0．01），聯(lián)合治療組較卡維地洛組GSH明顯增加，GSSG明顯減少（P＜0．01）；安慰劑組與假手術(shù)組相比較，bcl－2明顯減少（P＜0．01），藥物干預(yù)組與安慰劑組相比較，bcl－2均有增加（P＜0．01）。聯(lián)合治療組與卡維地洛組相比較，bcl－2進(jìn)一步增加（P＜0．05）。

表3 各組大鼠心肌組織中GSH／GSSG及凋亡蛋白（bcl－2）測(cè)定結(jié)果（±s）

表3 各組大鼠心肌組織中GSH／GSSG及凋亡蛋白（bcl－2）測(cè)定結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，1）P＜0．01；與安慰劑組比較，2）P＜0．01；與卡維地洛組比較，3）P＜0．05

組別 n GSH （μmol／L） GSSG（μmol／L） bcl－2（26KDa）假手術(shù)組8 7．06±0．16 0．90±0．02 1．06±0．06安慰劑組 10 5．46±0．071） 1．29±0．051） 0．63±0．051）卡維地洛組 10 6．09±0．111）2） 1．11±0．041）2） 0．86±0．311）2）聯(lián)合治療組 10 6．57±0．171）2）3）1．00±0．021）2）3） 0．98±0．032）3）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠心梗模型，心梗后對(duì)心功能影響的主要病理基礎(chǔ)是心梗后心肌重塑，即心梗后發(fā)生的左心室進(jìn)行性擴(kuò)張和外形改變［7］。一般認(rèn)為心梗后心肌細(xì)胞的壞死是導(dǎo)致左心室進(jìn)行性擴(kuò)張和外形改變主要病理機(jī)制，而近年來(lái)研究證明大鼠急性心肌梗死后，梗死區(qū)心肌細(xì)胞壞死和疤痕形成的同時(shí)，梗死／疤痕區(qū)、梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)均有不同比例的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］，因此心梗后的心肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是心肌細(xì)胞壞死之外引起左心室重塑和進(jìn)行性心功能惡化的一個(gè)重要因素［9，10］，即阻止心肌細(xì)胞凋亡，可減輕左心室重塑，改善心功能［11］。心梗后細(xì)胞凋亡的機(jī)制有很多，而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在心梗動(dòng)物模型中得到證實(shí)［12］，應(yīng)用抗氧化劑或還原性藥物增加谷胱甘肽的合成，或者維持谷胱甘肽在還原狀態(tài)可阻斷自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的進(jìn)展［13］，從而減輕左心室重塑，改善心功能。

β受體阻滯劑廣泛應(yīng)用于心梗及其后發(fā)生的心力衰竭的治療，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明［14－16］，β受體阻滯劑能降低心肌耗氧量，縮小梗死面積，減輕左心室重塑，改善心功能。β受體阻滯劑發(fā)揮上述作用的主要機(jī)制是通過(guò)β－受體阻滯的作用，減慢心率，降低左心室充盈壓和前負(fù)荷，降低舒張期室壁張力，減少心肌耗氧量和增加心肌供氧，以及抑制兒茶酚胺對(duì)心臟的直接毒性作用等。卡維地洛作為一種非特異性腎上腺素能受體阻滯劑，可阻滯β1－受體、β2－受體、α1－受體，其與美托洛爾相比，能更大程度地增加心肌收縮力，改善心功能，顯著降低患者的死亡危險(xiǎn)度［17］，原因可能在于其特有的抗氧化、抗增殖、抗凋亡作用［3］，但長(zhǎng)時(shí)間對(duì)β2－受體的阻滯有抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌重塑的不利作用，因此加用適量的β2－受體激動(dòng)劑加強(qiáng)其抗氧化、抗凋亡作用。

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在急性心梗的發(fā)病和疾病的進(jìn)程中均扮演了重要的角色［18］。GSH和GSSG是組成細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原對(duì)，在細(xì)胞的氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。本研究提示心梗8周后GSH明顯減少，GSSG增加，藥物治療組較安慰劑組GSH明顯增加，GSSG明顯減少，以聯(lián)合治療組顯著，說(shuō)明特布他林能夠進(jìn)一步加強(qiáng)卡維地洛的抗氧化作用；bcl－2具有抗細(xì)胞凋亡作用，影響著細(xì)胞的生存與凋亡［19］。心肌細(xì)胞凋亡蛋白（bcl－2）的結(jié)果表明：?jiǎn)斡每ňS地洛或聯(lián)用特布他林治療8周后，bcl－2表達(dá)均較安慰劑組明顯增高，且以聯(lián)合治療組顯著。因此推測(cè)選擇性β2AR激動(dòng)劑可加強(qiáng)非選擇性β1AR阻滯劑的抗氧化、抗凋亡作用，從而減輕心肌重塑，進(jìn)一步改善心功能。但β2AR具體抗氧化、抗凋亡機(jī)制尚不完全明了，有待進(jìn)一步深入研究。相關(guān)研究表明β2AR能同時(shí)與Gs和Gi發(fā)生耦聯(lián)，且以后者（抑制細(xì)胞凋亡作用）為主，因此激動(dòng)β2AR的綜合作用表現(xiàn)為抗凋亡及保護(hù)心臟［20］。

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