孟翔翔，狄曉艷，王孟本，* ，朱世忠，趙天梁

(1.山西大學黃土高原研究所，太原 030006;2.山西省林業(yè)調查規(guī)劃院，太原 030001)

油松是我國特有樹種，其自然分布范圍廣闊，介于31°—44°N和101°30'—124°25'E之間，呈非連續(xù)或島嶼狀分布格局［1-2］。天然地理屏障可能會阻礙種群間基因交流，導致種群間遺傳分化增大［3-4］。核DNA遺傳標記研究顯示，油松的遺傳變異主要存在于種群內，種群間已具有一定的遺傳分化［5］。

關于山脈屏障對植物遺傳分化的作用，已有人做了大量研究工作，但結果卻不盡相同。已有研究表明，山脈是美國短葉松(Pinus banksiana)［6］、中國青楊(populus cathayana)［7］、海岸松(Pinus pinaster)［8］基因交流和遷移的重要屏障，從而引起其遺傳譜系產生隔離;但山脈對歐洲水青岡(Fagus sylvatica)［9］和水曲柳(Fraxinus mandshurica)［10］種群遺傳分化卻沒有顯著作用。研究同時表明，東西走向山脈的阻隔作用是歐洲大陸第四紀冰期前后植物類群的差異大于北美大陸的重要因素［11］;東北-西南走向的山脈阻礙了白木香(Aquilaria sinensis)譜系間的基因交流，而對于走向與白木香擴張方向一致的山脈，其卻不阻礙白木香譜系間的基因交流［12］。

秦嶺是中國重要的南北自然分界線，呈東西向橫亙于中國中部，橫跨甘肅、陜西、河南三省。它既是我國亞熱帶與暖溫帶氣候的分界線，也是常綠闊葉林與落葉闊葉林的分界線［13］。賀蘭山位于阿拉善高原與銀川平原之間，大致呈南-北走向，是我國西北干旱區(qū)與半干旱區(qū)的分界線，也是溫帶荒漠與溫帶荒漠草原的分界線［14］。

在第四紀冰期氣候波動的影響下，松科植物(如油松)可能發(fā)生了與歐洲和北美相似的向南退縮和向北擴展的過程［15-16］，其線粒體為母系遺傳，更容易反映群體分化的模式［4，17-19］?；诖?，本研究以分布于秦嶺、賀蘭山和晉陜兩省的10個天然油松種群為研究對象，采用線粒體DNA序列測定技術，對種群的單倍型進化關系以及種群的聚類特點等進行研究，以探究地理阻隔對油松遺傳結構的影響。此項研究對深入認識油松遺傳結構的形成機制具有一定意義，同時可為進一步探討中國北方植物區(qū)系現(xiàn)存分布格局形成機制提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究選取了來自秦嶺、賀蘭山和晉陜兩省的10個天然油松種群共100個個體的針葉樣品。每個種群取樣10個，個體之間距離大于100 m。所采針葉置于硅膠中迅速干燥，密封于塑料口袋帶回實驗室，-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｓ退刹蓸拥攸c概況［5］見圖1和表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用改進的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法［20］，從硅膠干燥的針葉中提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增及測序

分別采用線粒體nad1內含子(f-gAT Cgg CCA TAA Atg TAC TCC，r-CCC CAT ATA TAT TCC Cgg AgC［21］)和matR內含子(f-CgA CAg AAg CAC gAA ATT CC，r-ACC CgA CgA TAA CTA gCT TC［22］)引物序列進行擴增。PCR 反應為 25 μl，其中含有 1×PCR buffer，總 DNA 30—50 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，taq 酶 1 U，引物 0.4 μM;反應條件為:94 ℃預變性 4 min，94 ℃變性 30 s，54 ℃(nad1)/58℃ (matR)退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后延伸5 min。擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Gel Extraction Kit純化試劑盒(bio-tec OMEGA，USA)按推薦步驟進行純化，純化產物送往上海立菲生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理:

采用MEGA 5.1中的ClustalX軟件對所得序列進行比對(并進行適當手工校正)，以得到不同序列(即不同單倍型)。同時采用MEGA 5.1中的相應模塊對多態(tài)性位點、簡約信息位點、各堿基含量、核苷酸多樣性進行計算;對單倍型間和種群間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離進行計算;并構建種群鄰接聚類圖。采用NETWORK 4.6.1.1軟件 (http://www.fluxus-engineering.com)［23］構建單倍型網絡關系圖。采用PHYLIP 3.69軟件中的最大簡約法(MP)構建單倍型聚類圖。采用ARLEQUIN軟件中的AMOVA對種群間的遺傳分化是否顯著進行檢驗。

圖1 10個天然油松種群的地理位置(黑點)及其單倍型分布概況(餅狀圖)Fig．1 Geographic location(black dots)of the 10 natural populations of Pinus tabulaeformis，and their mitotype distribution(pie chart)Hli等為種群代號(詳見表1);不同顏色代表不同的單倍型

2 結果

2.1 線粒體DNA序列變異與單倍型

比對后的10個天然油松種群的100個個體線粒體DNA的nad1片段長度為1093—1280 bp，校正后長度為1366 bp，共包括168個多態(tài)性位點，其中34個簡約信息位點，134個單變位點。線粒體matR片段長度為475—477 bp，校正后長度為478 bp，共包括4個多態(tài)性位點，其中1個簡約信息位點，3個單變位點，核苷酸 T、C、A、G平均比例分別為 25.83%(25.44%—26.58%)、23.94%(23.17%—24.16%)、22.17%(21.92%—22.98%)、28.06%(27.01%—28.41%)，A+T含量(48%)略低于C+G含量(52%)。序列變異含有堿基缺失/插入和堿基替換等，共得到27個單倍型(表1)，其中單倍型h1為所用種群所共有，占所有個體數(shù)的54%，是分布最廣的單倍型;單倍型h3分布于HLn，HL和TY種群中，單倍型h6分布于HLn、HLi和ZZ種群，單倍型h9分布于HLn和NX種群，單倍型h27分布于HLn、LY、GD、LC和HL5個種群中，其余22個單倍型僅存在于單個種群中。由此可見，兩個種群(LC和NS)僅有共有單倍型，而其余種群則分別具有1—4個獨有單倍型。

表1 供試油松種群的地理位置及其單倍型類型Table 1 Geographic location of the populations of Pinus tabulaeformis，and their haplotypes

就位于秦嶺或賀蘭山兩側的種群而言，秦嶺南側的NS和NX種群與秦嶺北側的ZZ和LC種群有一個共有單倍型，賀蘭山東西兩側的HLn和HLi種群具有兩個共有單倍型。秦嶺南側NX種群和北側ZZ種群分別具有兩個和一個獨有單倍型;賀蘭山東側種群(HLn)和西側種群(HLi)均具有3個獨有單倍型。相比之下，晉陜種群(即油松分布區(qū)中心種群HL、TY、GD和LY)則分別具有2—4個獨有單倍型。由此可見，秦嶺種群或賀蘭山種群的獨有單倍型平均數(shù)目(分別為3/4和6/2)明顯小于分布區(qū)中心種群(13/4)。

2.2 單倍型間的進化關系

如圖2所示，27個單倍型且可合并為12個單倍型(其中h1—h14合并為h1，h25—h27合并為h25)，其分布大致呈三葉草形，h25位于交匯中心，主要涉及GD與LY，LC，HL和HLn種群;h22和h23獨立為一支，分別涉及HLi和HLn種群;h1，h16、h17和h20、h21為一支，其中h16和h17為TY種群的獨有單倍型，h20和h21為NX種群的獨有單倍型;h18，h19和h24形成第三支，分別為LY，ZZ和HLn種群的獨有單倍型。由此可知，各種群單倍型之間的關系比較復雜。盡管如此，從圖2仍然可以看出，位于賀蘭山東西兩側種群的獨有單倍型(h22和h23)緊鄰且獨成一支。位于秦嶺南北兩側種群的獨有單倍型(h20，h21與h19)之間僅存在三個進化節(jié)點，說明其關系較近。同時可以看出，位于賀蘭山東側種群的獨有單倍型(h23)與晉陜種群的某些獨有單倍型(h25和h15)的關系也比較近。位于秦嶺北側種群的獨有單倍型(h19)與晉陜種群的獨有單倍型(h18、h25和h15)的關系同樣較近。

圖2 油松種群27個單倍型的網絡關系圖Fig．2 Network relationship chart of the 27 haplotypes from Chinese pine populationsh代表單倍型，h1包括單倍型h1—14，h25包括h25—27，圓圈大小代表單倍型頻率，不同顏色代表不同的種群;圖例解釋見表1

從圖3同時可以看出，這些單倍型可大致聚為3組。其中單倍型h1-h15(除h7之外)為第一組，單倍型h16-h24為第二組，單倍型h25，h26，h27和h7為第三組。圖3中的第一組單倍型(除h15)和第三組單倍型(除h7)在圖2中各自為一個單倍型(h1和h25)，同樣表明第一組或第三組各個單倍型有著更近的親緣關系。然而，在第一組中，單倍型h9，h13和h3，h10分別存在于賀蘭山東西兩側種群之中(其中h13和h10分別為獨有單倍型);h9和h6分別存在于秦嶺的南北兩側種群之中。在第二組中，則顯示出與圖2相類似的結果，即h18，h19和h24為一亞組，h22和h23為一亞組;h16、h20和h21為一亞組?？傮w來看，在秦嶺南北兩側和賀蘭山東西兩側的3對種群9個獨有單倍型中，有8個獨有單倍型的關系較近(h19與h20，h19與h21，h13與h10，h24與h22，h22與h23)。與此同時，位于秦嶺北側種群的獨有單倍型(h19)與晉陜種群的獨有單倍型(h17和h18)的關系也比較近。位于賀蘭山東側種群的獨有單倍型(h23和h24)與晉陜種群的某些獨有單倍型(h16、h17和h18)的關系同樣較近。

以上分析說明，油松種群單倍型間的親緣關系比較復雜。秦嶺、賀蘭山和晉陜3組種群之間不僅具有共有單倍型，多數(shù)種群且具有各自的獨有單倍型。但是，位于秦嶺或賀蘭山兩側種群的獨有單倍型之間的關系有時(如圖2所示)甚或往往(如圖3所示)較近。而且秦嶺北側或賀蘭山東側種群的獨有單倍型與油松分布區(qū)中心種群的某些獨有單倍型的關系亦較近。這意味著山脈地理屏障與油松的遺傳分化沒有明顯關系。

2.3 種群遺傳多樣性和遺傳距離

圖3 油松27個單倍型的最大簡約(MP)聚類圖Fig.3 Cluster result of 27 mtDNA haplotypes of Pinus tabulaeformis using maximum parsimony(MP)method

油松種群線粒體nad1和matR序列分析表明，總體水平(100個個體)的單倍型多樣性為0.7120，核苷酸多樣性為0.0050(表2)。種群內單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0—0.9111和0—0.0176。其中NX種群核苷酸多樣性最高，其次為TY、LC、ZZ種群，而NS種群核苷酸多樣性最低。AMOVA分析表明(表3)，所有種群的90.16%的遺傳變異分布于種群內，9.84%的遺傳變異分布于種群間。但是種群間遺傳分化仍然很顯著。對秦嶺、賀蘭山和晉陜3組種群而言，秦嶺種群間或晉陜種群間遺傳分化極顯著，而賀蘭山種群間遺傳分化則不顯著。

表2 油松種群的單倍型多樣性(Hm)和核苷酸多樣性(π)Table 2 Haplotype diversity(Hm)and nucleotide diversity(π)for 10 nature populations of Pinus tabulaeformis

表3 基于線粒體序列的天然油松種群的分子方差分析(AMOVA)Table 3 Analysis of molecular variance(AMOVA)of mitotypes in the populations of Pinus tabulaeformis

從種群之間的遺傳距離(表4)可知，NX種群與其他種群之間的遺傳距離均比較大，其次為TY種群。如圖4所示，若以0.0015為臨界值，可將供試種群分為6組，即HLi和HLn各為一組，LY、GD和LC為一組，HL、NS和ZZ為一組，NX和TY各為一組。說明油松種群間的聚類關系比較復雜。很顯然，這種聚類關系與油松單倍型間的復雜進化關系密切相關。

表4 油松種群間的遺傳距離Table 4 Genetic distance among the 10 populations of Pinus tabulaeformis

盡管秦嶺南、北兩側種群(NS與ZZ)或賀蘭山東、西兩側種群(HLi與HLn)的聚類關系較近，但是由于NX和TY各分為一組，而LC歸為另一組，秦嶺南、北兩側種群與油松分布區(qū)中心種群之間表現(xiàn)出復雜的聚類關系。同樣由于TY單獨為一組，HLi與HLn各為一組，賀蘭山東西兩側種群與油松分布區(qū)中心種群之間亦表現(xiàn)出比較復雜的關系。這從另一個側面說明，位于秦嶺南北兩側或賀蘭山東西兩側種群之間的遺傳分化與山脈屏障的存在沒有明顯關系。

圖4 基于Kimura雙參數(shù)距離的油松天然種群的鄰接聚類圖Fig．4 Neighbor-joining tree based on Kimura 2-parameter distance in populations of Pinus tabulaeformis

3 討論

遺傳多樣性是物種適應環(huán)境的基礎。遺傳多樣性的高低可以在一定程度上反映物種的進化過程、進化潛力，以及物種對環(huán)境的適應能力。松科植物線粒體基因具有母系遺傳特性，不經歷重組，能更直接地反映植物的進化特征。對mtDNA序列的分析顯示，在供試油松種群中共檢測到27個單倍型。單倍型h1為各種群所共有，可能為一個古老單倍型。除h3，h6，h9和h27這4個單倍型為2—5種群共有之外，其余22個單倍型分別為8個種群所獨有。整體而言，油松具有較高的單倍型多樣性(0.7120)和核苷酸多樣性(0.0050)。盡管遺傳多樣性主要存在于種群內(90.16%)，種群間遺傳分化仍然很顯著(Fst=0.0984，P＜0.001)。這與已有研究結果［5，24-25］相一致。由此可見，油松種群在長期的進化過程中的確產生了明顯分化。

山脈尤其是東西走向的山脈，在第四冰期時對種群的分子進化可能起到重要作用［26］。山脈主要是通過阻礙花粉和種子傳播，從而影響基因流，導致種群間的遺傳分化。種群遺傳分化程度通常用遺傳分化指數(shù)(Fst)表示。本研究顯示，與晉陜種群的遺傳分化指數(shù)(0.2239)相比，秦嶺種群的遺傳分化指數(shù)(0.0122)和賀蘭山種群的遺傳分化指數(shù)(-0.0264)均較小(盡管秦嶺種群或晉陜種群的遺傳分化顯著，而賀蘭山種群的遺傳分化不顯著)(表3)。這意味著山脈屏障與油松的遺傳分化沒有多大關系。

賀蘭山種群的遺傳分化指數(shù)為負值，且種群內變異超過了100%(102.64%)。根據(jù)葉瑩瑩等的對類似結果的分析［27］，可以認為賀蘭山兩側的兩個油松種群間無遺傳分化。這同樣說明賀蘭山對其兩側油松種群的遺傳分化幾乎沒有任何影響。

就單倍型而言，盡管秦嶺南、北側或賀蘭山東、西側種群各有自己的獨有單倍型，但與晉陜種群相比，其獨有單倍型的平均數(shù)較小。盡管各種群單倍型之間的關系錯綜復雜，但是從單倍型的網絡關系和最大簡約聚類圖中仍然可以比較清楚地看出，位于秦嶺南北兩側或賀蘭山東西兩側種群的獨有單倍型之間關系往往比較接近(如圖2中h19與h20和h21;h22與h23;圖4中h19與h20，h19與h21;h13與h10，h22與h24，尤其是h22與h23)。已有油松譜系地理學研究也表明，太白山種群和寧陜種群之間沒有明顯遺傳分化［4］。這些分析說明，油松的遺傳結構與其分布區(qū)山脈屏障的存在沒有明顯關系。

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