王 暖 耿德勤 黃紅莉 周 昊 楊秀華 (徐州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 徐州 22002)

衰老與海馬細胞凋亡以及神經(jīng)元存活信號轉導通路的變化有著密切聯(lián)系，但眾說不一。磷脂酰肌醇3-激酶 (PI3K)-AKt-Caspase-9信號轉導途徑是細胞內(nèi)重要的信號轉導通路，在細胞的凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的變化等活動中發(fā)揮重要的生物學功能，其中尤為重要的是它對細胞凋亡、存活的調(diào)節(jié)作用〔1，2〕。而老年大鼠是否存在 PI3K-AKt-Caspase-9信號轉導通路的障礙，尚不十分清楚。本研究探討老年大鼠海馬組織細胞凋亡、PI3K-AKt-Caspase-9信號轉導通路與學習記憶的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器 健康SD大鼠:青年鼠(8月齡，200～250 g)，老年鼠(24月齡，450～500 g)各8只，雌雄各半，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。Caspase-9 P35抗體、PI3K P85抗體、AKt抗體、p-AKt(ser473)抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司，p(Tyr)-PI3K P85抗體購自美國cell signaling公司，Y型迷宮、免疫組化試劑盒和TUNEL試劑盒均購自國內(nèi)。

1.2 學習記憶能力測試 兩組大鼠分別進行Y型迷宮實驗。連續(xù)10次電擊中有9次正確為達到學會標準，記錄動物達到標準所需電擊的次數(shù)，以此作為學習快慢程度的指標，24 h后重復以上實驗過程，觀察大鼠的記憶能力。

1.3 TUNEL染色和免疫組化染色 Y迷宮測試24 h后留取8只(每組4只)大鼠麻醉，仰臥于固定臺上，暴露心臟，經(jīng)左心室插入導管至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水100～150 ml，再灌注4℃4%多聚甲醛300 ml，然后斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處以冠狀切面切開鼠腦留取中間切塊，入4%多聚甲醛中后固定24～48 h，然后按以下程序進行:固定后組織塊經(jīng)流水沖洗1～1.5 h，80%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，每一組織塊作5 μm的連續(xù)切片，貼于載玻片，60℃ ～70℃烤片6 h以上以備TUNEL法染色和免疫組化染色。染色方法按試劑盒說明書進行。在400倍鏡下左側海馬區(qū)隨機取5個不重疊的視野進行TUNEL、p-PI3K P85、p-AKt和Caspase-9 P35陽性神經(jīng)元計數(shù)(個/視野)，結果取5個視野的平均值。

1.4 Western印跡 余8只大鼠冰浴上斷頭取腦，剝離雙側海馬進行組織勻漿;離心15 min;取上清用lowary法測蛋白含量;分裝，－20℃凍存?zhèn)溆?取30 μl蛋白在SDS-PAGE膠中電泳;之后將蛋白質(zhì)轉至NC膜;取出膜后用BSA封閉室溫下振搖3 h，以阻斷非特異性結合;再分別加入1∶200稀釋的一抗(p-PI3K P85、P-AKt、PI3K P85、AKt、Caspase-9 P35)4℃ 孵育過夜;反應完后二抗溫育2 h，AP顯色系統(tǒng)顯色。

2 結果

2.1 大鼠學習及記憶能力比較 與青年大鼠相比，老年大鼠學習嘗試次數(shù)明顯增加，記憶正確次數(shù)明顯減少，差異均有極顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠學習及記憶能力比較(± s，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別 學習嘗試次數(shù)(次) 記憶正確次數(shù)(次)青年組50.0±6.3 7.7±0.5老年組 75.0±5.51) 4.0±0.91)

2.2 大鼠海馬區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)比較 青年大鼠海馬區(qū)未見TUNEL陽性神經(jīng)元。老年大鼠可見到較多TUNEL陽性神經(jīng)元(36.3±1.1)，其細胞核固縮深染，呈現(xiàn)棕黃色，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見圖1。

2.3 免疫組化染色結果 青年組海馬區(qū)可見較多p-PI3K、p-AKt陽性表達細胞，其染色深，胞漿著色呈棕黃色。老年組海馬區(qū)陽性表達細胞明顯減少，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。青年組海馬區(qū)偶見Caspase-9P35陽性神經(jīng)元。老年組海馬區(qū)可見較多Caspase-9P35陽性表達細胞，其染色深，棕黃色顆粒主要沉積在胞核周圍，與青年組相比，差異有極顯著性(P＜0.01)。見表2，圖2～圖4。

圖2 大鼠海馬P-PI3表達(DAB，×400)

圖3 大鼠海馬p-AKt表達(DAB，×400)

圖4 大鼠海馬Caspase-9P35表達(DAB，×400)

表2 兩組大鼠海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經(jīng)元數(shù)比較(±s，n=4，個/視野)

表2 兩組大鼠海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt、Caspase-9p35陽性神經(jīng)元數(shù)比較(±s，n=4，個/視野)

與青年組比較:1)P＜0.01

組別p-PI3K陽性神經(jīng)元p-AKt陽性神經(jīng)元Caspase-9p35陽性神經(jīng)元青年組36.0±2.6 24.0±2.9 7.0±1.8老年組 9.4±2.01) 8.7±1.11) 25.5±2.41)

2.4 Western印跡結果 與青年組相比，老年組海馬區(qū)p-PI3K、p-AKt的活性明顯降低，Caspase-9p35蛋白表達明顯增加(P＜0.01);PI3K、AKt蛋白表達在兩組之間變化無統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖5 兩組大鼠海馬組織p-PI3K、PI3K、p-AKt、AKt及Caspase-9p35蛋白表達

3 討論

近年來在細胞生物學和分子生物學迅速發(fā)展的推動下衰老機理的研究已取得了重大進展，其中最具有代表性的學說有:自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說和基因?qū)W說〔3，4〕。大量資料顯示，衰老大鼠不但出現(xiàn)基底前腦膽堿能神經(jīng)元的丟失、海馬的膽堿能纖維減少和膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性下降，而且出現(xiàn)學習記憶障礙。在本研究中，使用Y型電迷宮評價了老年鼠的學習記憶功能，表現(xiàn)為學習嘗試次數(shù)明顯增多，記憶正確次數(shù)明顯減少，結果表明老年大鼠發(fā)生了嚴重的學習記憶障礙。

有證據(jù)表明，在老化過程中存在著神經(jīng)細胞的凋亡，表現(xiàn)為一些部位神經(jīng)細胞的減少、細胞對外界刺激不可修復的生物學反應和細胞不能夠?qū)ι嫘盘柶鸱磻罱K導致死亡的一種生物學過程〔5〕等。衰老機體生長因子合成降低、跨膜信號缺陷、控制細胞增殖的特殊基因表達缺陷，不能對付氧化應激，使得衰老機體易于激發(fā)凋亡過程〔6〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)生長因子(NGF)等因子與其相應受體結合〔7〕，啟動PI3K信號轉導途徑，通過PI3K-Akt-caspase-9通路，使神經(jīng)元存活并維持正常功能。PI3K/AKt通路是一個公認的細胞存活通路，介導多種生長因子的生物學效應，如促細胞存活、誘導細胞分化和促細胞生長等〔8～10〕，是抗凋亡、促進細胞增殖的重要信號途徑〔11，12〕。caspase-9 是活化的 AKt主要下游靶蛋白，完整的caspase-9即procaspase-9為46 000多肽是沒有活性的前蛋白，激活后裂解為37000或35000的活性片段〔13〕。本實驗檢測的就是有活性的片段caspase-9 p35。Perianayagam等〔14〕注意到，C5a處理的中性粒細胞中caspase-9活性在加入PI3K抑制物Wortmannin后顯著提高。當各種原因引起神經(jīng)存活因子減少或損傷性因素增加時，對信號傳導通路的刺激減弱，使多種維持神經(jīng)元存活的重要蛋白不能隨之激活，由此引起神經(jīng)元功能減退和細胞凋亡進而影響大鼠的認知功能〔15〕。本實驗結果說明老年大鼠海馬神經(jīng)元存在著PI3K-Akt-caspase-9信號轉導通路的障礙，可能是導致老年大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡、學習記憶功能衰退的重要機制。

總之，老年鼠在衰老過程中，由于PI3K-Akt-caspase-9信號轉導通路的障礙，導致海馬神經(jīng)元凋亡，由于海馬是動物學習、記憶的重要神經(jīng)解剖學結構〔16〕，故導致學習記憶能力下降。

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