鐘嬋娟 ，孫德四 ，王化軍，張 強

(1. 九江學院 化學與環(huán)境工程學院，九江 332005；2. 北京科技大學 土木與環(huán)境工程學院，北京 100083)

隨著優(yōu)質(zhì)鋁土礦資源的日趨匱乏及人類對環(huán)境保護意識的增強，開發(fā)環(huán)境友好的低鋁硅比鋁土礦選礦脫硅技術(shù)日益受到人們的重視[1-2]。長期以來，鋁土礦脫硅主要采用高污染與高能耗的物理及化學方法[3]。而微生物方法脫硅因其具有高選擇性、高脫硅率與無環(huán)境污染等優(yōu)點曾廣受關(guān)注[4-6]。在 20世紀 70—90年代，鋁土礦微生物選礦研究在俄羅斯、保加利亞與印度開展較為活躍，并取得了大量的理論研究成果，但進入21世紀以來，還未見相關(guān)報道，且至今尚無工業(yè)化應(yīng)用實例[7-9]。鋁土礦中的硅主要賦存于脈石礦物如高嶺石、石英等硅酸鹽礦物中，因此，鋁土礦微生物選礦的實質(zhì)是利用特定微生物風化降解鋁土礦中的硅酸鹽礦物，從而釋放其中的硅、鐵等有害元素[10]。大量研究表明，微生物主要通過有機酸、生物膜、胞外聚合物和氧化還原作用的方式風化硅酸鹽礦物，微生物產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外聚合物的能力直接影響其對硅酸鹽礦物的降解效果[11-16]。迄今為止，從土壤與鋁硅酸鹽礦場中分離得到了細菌、真菌等多個能分解硅酸鹽礦物的微生物種屬[17-22]。至今用于鋁土礦脫硅的菌種中效果最好的為環(huán)狀芽孢桿菌Bacillus circulans(B·C)與黏液膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillus mucilaginosus(B·M)。浸礦過程中，菌種對鋁硅酸鹽的脫硅作用是由細菌代謝產(chǎn)生的大分子胞外聚合物與硅結(jié)合成絡(luò)合物的直接作用，以及細菌代謝與分解大分子有機物產(chǎn)生的小分子有機酸酸解硅酸鹽或鋁硅酸鹽的間接作用兩部分組成的[14,23-25]。目前，所有有關(guān)鋁土礦微生物選礦技術(shù)仍處于理論與實驗室研究階段，制約其工業(yè)化應(yīng)用的原因主要有：菌種生長速率緩慢，生物浸出周期較長；優(yōu)良浸礦性能菌種篩選難度大，不同環(huán)境篩選所得菌種產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外聚合物的能力不同；菌種性能不穩(wěn)定，多次傳代培養(yǎng)后分解硅酸鹽礦物的能力會顯著降低。這些缺陷急需在生物浸礦過程中得到解決。

誘變育種作為一種有效地提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的手段得到了廣泛應(yīng)用。在濕法冶金與礦物加工領(lǐng)域，國內(nèi)外有關(guān)浸礦菌種的誘變育種技術(shù)的大量研究成果主要應(yīng)用于銅礦、硫鐵礦等重金屬與貴金屬礦物的生物浸出[26-28]。目前，除Groudeva[6]采用環(huán)狀芽孢桿菌與粘液芽孢桿菌的誘變菌種對鋁土礦進行脫硅研究外，至今國內(nèi)外很少有關(guān)用于鋁土礦脫硅的“硅酸鹽”細菌誘變育種方面的報道。具有氧化活性的誘變劑通過對 DNA 中堿基的氧化損傷發(fā)揮致突變作用，因其誘變效果好而備受關(guān)注。其中亞硝酸及其鹽是一種常用的氧化性誘變化學藥劑，它們中的硝基可氧化微生物中 DNA 的腺嘌呤，使腺嘌呤經(jīng)脫氨基氧化后變成次黃嘌呤。而次黃嘌呤則在 DNA 復制中替代 G與 C 配對，其主要生物效應(yīng)是引起細菌 DNA 鏈AT→GC 的轉(zhuǎn)換[29-30]。

本文作者選用兩株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的膠質(zhì)芽孢桿菌B·MCGMCC11和 環(huán)狀芽孢桿菌B·CCGMCC12作為出發(fā)菌株，采用亞硝酸鈉(NIT) 對出發(fā)菌株進行誘變育種，通過對誘變菌株的初篩與復篩及遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)，篩選出兩株正突變菌B·MCGMCC11KP 和B·CCGMCC12KP，并以出發(fā)菌株作為對照，采用單獨菌株與混合菌株對鋁土礦進行浸礦分解及脫硅試驗研究。

1 實驗

1.1 試驗礦樣

試驗所用純高嶺石礦樣購買于中國地質(zhì)博物館，礦樣純度為98%；浸礦用鋁土礦樣品采自河南中州鋁廠(焦作)選礦鋁土礦原礦樣，為沉積型一水硬鋁石鋁土礦，脈石礦物主要為硅酸鹽礦物，通過XRD分析，其主要礦物組成(質(zhì)量分數(shù))為：水鋁石 64.6%， 高嶺石16.50%，伊利石9.1%，石英1.63%，鐵礦物5.40%，方解石2.50%。主要化學成分組成(質(zhì)量分數(shù))為：Al2O365.00%，SiO212.58%，F(xiàn)e2O34.53%，TiO21.09%，K2O 1.09%，CaO 1.55%，MgO 0.13%，Na2O 1.17%。

1.2 出發(fā)菌株與培養(yǎng)基

試驗所用的兩株出發(fā)菌種為膠質(zhì)芽孢桿菌B·MCGMCC11 和 環(huán)狀芽孢桿菌B·CCGMCC12，購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。兩株菌種的表型特征基本一致，在硅酸鹽鹽細菌平板培養(yǎng)基上的菌體特征(28 ℃，培養(yǎng)3 d)為菌體呈桿狀，兩端鈍圓，形成無色透明隆起菌落，菌落表面光滑，富有彈性，挑起時能拉成很長的絲，革蘭氏陰性。但B·CCGMCC12 在平板上產(chǎn)生的芽孢比B· MCGMCC11的大且多，粘度較B·MCGMCC11 的低。在含純高嶺石的該類菌種的專性培養(yǎng)基中，在初始pH值為7.0，溫度為28～30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150～200 r/min的條件下，培養(yǎng)7 d 后，兩株菌種的上清液中SiO2的質(zhì)量濃度可達到40 mg/L左右，表明出發(fā)菌株具有較高的分解鋁硅酸鹽礦物能力，并能釋放其中的硅。

兩株菌種的固體與液體培養(yǎng)基均為硅酸鹽細菌專性培養(yǎng)基[10,13]。

1.3 細菌誘變

試驗菌株在硅酸鹽細菌改性培養(yǎng)基(專性培養(yǎng)基+(NH4)2SO4)中擴大培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌液在5 000 r/min條件下離心分離20 min，去上清液，收集菌體，然后用無菌水制備成菌懸浮液，菌體密度控制在 107～108個/mL。

亞硝酸鈉(NIT)誘變：取菌懸浮液 10 mL，分別加入250 mL 錐型瓶中，瓶中裝有90 mL含不同質(zhì)量濃度(0、5、10、20、40、60和80 mg/L)NIT的硅酸鹽細菌改性培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min條件下處理40 min，然后離心分離，并用無菌水洗滌3次，除去NIT，終止誘變。 然后取各誘變菌液1 mL稀釋涂布于改性培養(yǎng)基瓊脂平板上，在30 ℃下培養(yǎng) 48 h 后進行菌落計數(shù)，計算致死率，確定最佳誘變劑量并挑取該誘變劑量下的菌落進行初篩與復篩。菌株的正突變率由傳代時間、生長穩(wěn)定期和在發(fā)酵培養(yǎng)液中產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的量共同決定。菌株的代謝能力通過裝有90 mL硅酸鹽細菌改性培養(yǎng)基+2 g高嶺土礦粉的250 mL錐型瓶中進行培養(yǎng)測定，試驗條件同1.2節(jié)所述。在培養(yǎng)過程中，每隔1 d 測定發(fā)酵液中的pH 值與黏度；菌株的生長穩(wěn)定期通過對細菌在裝有不含礦樣的純發(fā)酵液體培養(yǎng)基的錐型瓶，在以上同樣條件下培養(yǎng)測定。

誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性測定：將篩選出的相對較高代謝活性的菌株在含高嶺石的液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7代，并于第7代測定培養(yǎng)液中的pH 值與黏度隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律，考察誘變菌株代謝活性的穩(wěn)定性。

1.4 鋁土礦細菌浸出試驗

在250 mL錐型瓶中裝入90 mL的硅酸鹽細菌專性培養(yǎng)基，接入對數(shù)生長期菌液(細菌初始濃度1.1×106個/mL)，礦漿質(zhì)量濃度為45 g/L，在30 ℃、初始pH值為7.2、200 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)15 d，定期測定上清液中SiO2的質(zhì)量濃度。設(shè)計7個試驗浸礦體系，每個體系做3個平行試驗：1) 培養(yǎng)基中接種誘變前的出發(fā)菌株B·MCGMCC11；2) 培養(yǎng)基中接種誘變菌株B·MCGMCC11KP；3) 培養(yǎng)基中接種誘變前的出發(fā)菌株B·CCGMCC12；4) 培養(yǎng)基中接種誘菌株B·CCGMCC12KP；5) 培養(yǎng)基中接種誘變前的混合出發(fā)菌株B·MCGMCC11+B·CCGMCC12(1:1)；6) 培養(yǎng)基中接 種 誘 變 混 合 菌 株B·MCGMCC11KP+B·CCGMCC12KP(1:1)；7) 對照組 CK(不接菌)。

1.5 測試分析方法

細菌浸出液中的硅形態(tài)主要有兩種：細菌代謝產(chǎn)物(主要指胞外聚合物)對石英、高嶺石與伊利石等微細顆粒(≤45 μm)硅酸鹽礦物具有一定的分散作用，所以浸出液中一部分硅賦存于這些礦物中，以硅酸鹽礦物形態(tài)存在，這一部分硅為非活性硅，但在HF作用下可以消解；另一部分硅在酸解、大分子有機酸等胞外聚合物的絡(luò)解作用下以硅酸與有機硅的形態(tài)存在于浸出液體中，這一部分硅稱為活性硅，可以與鉬酸銨直接進行顯色反應(yīng)。

上清液中硅含量以SiO2的質(zhì)量濃度進行定量，采用硅鉬藍分光光度法(721E分光光度儀，上海光譜公司生產(chǎn))測定；pH 值用 PHS-3C 型 pH 計(上海雷磁儀器廠生產(chǎn))測定；浸礦上清液黏度用黏度計測定，儀器型號為 NDJ-5(上海天平廠生產(chǎn))；細菌培養(yǎng)液及浸礦上清液中的細菌數(shù)量在XS-212生物顯微鏡(南京江南永新光學儀器)下用平板計數(shù)法測定；用SEM(型號為VEGA∥LSU，TESCAN公司生產(chǎn))與XRD(D/Max-2500型 X 射線衍射儀，日本 Rigaku 生產(chǎn))觀察細菌浸出前后鋁土礦的表面微觀形態(tài)及礦物組成變化。

1.6 細菌浸礦后期浸出液中微生物群落組成分析

細菌 DNA提取與純化采用 UNIQ-10 柱式試劑盒。采用上游引物(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′)和下游引物為(5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′) 擴增16S rRNA 基因片斷。通過低熔點瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 結(jié)果，使用UNIQ-10 柱式試劑盒試劑盒回收目的片斷。將轉(zhuǎn)化后重組菌涂瓊脂平板30 ℃過夜培養(yǎng)，LB 瓊脂平板加入 5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside，篩選出100個目的菌落，使用載 體 引 物 7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′) 和1540r(1522)(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，將攜帶重組質(zhì)粒的細菌破壁，進行菌落PCR 擴增。16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) HindI 和 MspI(Fermentas)30℃酶切過夜，3.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外光下觀察擴增性 16S rDNA 限制性酶切片段分析結(jié)果，與試驗出發(fā)菌株的 16S rDNA 限制性酶切片段進行比較分析。以上主要試劑的提供與基因測序工作由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 出發(fā)菌株的生理生化特性

pH值和溫度對B·MCGMCC11和B·CCGMCC12生長的影響見表1和2。由表1和2可見，兩株出發(fā)菌株在pH 值為5.0～9.1 和溫度為25～35 ℃的范圍內(nèi)都能生長；最佳pH 值范圍為7.2～8.3，最適溫度范圍為28～30℃；B·MCGMCC11 生長的最佳pH值為7.2，最適溫度為28 ℃；B·CCGMCC12 生長的最佳 pH 值為8.3，最適溫度為30 ℃。盡管兩株菌的最佳pH 值和最適溫度的差別不大，但根據(jù)前期浸礦實驗結(jié)果，B·MCGMCC11的浸礦效果明顯要比B·CCGMCC12的好，在浸礦中起主要作用，所以，在組合菌種的浸礦試驗中取pH=7.2，溫度為28 ℃。

表1 pH 值對 B·M CGMCC11 和 B·C CGMCC12 生長的影響Table 1 Effect of pH value on B·M CGMCC11 and B·C CGMCC12 growth

表2 溫度對 B·M CGMCC11 和 B·C CGMCC12 生長的影響Table 2 Effect of temperature on B·M CGMCC11 and B·C CGMCC12 growth

2.2 B·M CGMCC11的亞硝酸鈉誘變結(jié)果

B·MCGMCC11 的致死率和正突變率如圖 1 所示。從圖1可見：致死率與亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度成正比，以細菌在穩(wěn)定期具有比原始菌株更大的菌體密度為正突變指標。當亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度為 40 mg/L時，致死率為87%，正突變率為18%，為最佳誘變劑量。從正突變菌株中選取傳代時間或到達生長穩(wěn)定期時間較短的菌體用于浸出試驗，并經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)后獲得的誘變菌株編號為B·MCGMCC11KP。

B·MCGMCC11 誘變前和誘變后的生長曲線如圖2 所示。從圖2可見：誘變后正突變菌株達到穩(wěn)定期的時間為5 d，比原始菌株提前了2 d，菌體密度也由原來的108個/mL左右上升到109個/mL左右。

圖1 亞硝酸質(zhì)量濃度對B·M CGMCC11的致死率的影響Fig. 1 Effect of mass concentration of NIT on lethal ratio of B·M CGMCC11

圖2 B·M CGMCC11誘變前后的生長曲線Fig. 2 Growth curves of B·M CGMCC11 before and after NIT-induced mutagenesis

2.3 B·C CGMCC12的亞硝酸誘變結(jié)果

B·CCGMCC12 的致死率和正突變率如圖 3所示。從圖3 可見：B·CCGMCC12 的致死率與亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度成正比，以細菌具有比出發(fā)菌更快達到生長穩(wěn)定期和在生長穩(wěn)定期具有更高菌體密度為正突變指標。當亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度為60 mg/L 時，致死率為85%，正突變率為20%，為最佳誘變劑量。同樣，從正突變菌株中選取傳代時間或到達生長穩(wěn)定期時間較短的菌體用于浸出試驗，并經(jīng)7次傳代培養(yǎng)后，獲得的誘變菌株編號為B·C CGMCC12KP。

B·CCGMCC12 誘變前和誘變后的生長曲線如圖4 所示。由圖 4 可見：誘變后正突變菌株B·C CGMCC12KP 達到穩(wěn)定期的時間為6 d，比原始菌株提前了1 d，菌體密度也由原來的108個/mL 左右上升到大于109個/mL。

圖3 亞硝酸質(zhì)量濃度對B·C CGMCC12的致死率的影響Fig. 3 Effect of mass concentration of NIT on lethal ratio of B·C CGMCC11

圖4 B·C CGMCC12誘變前后的生長曲線Fig. 4 Growth curves of B·C CGMCC11 before and after NIT-induced mutagenesis

最佳的亞硝酸鈉誘變劑量取決于細菌自身的特性及基因的特異性，試驗表明：對于B·MCGMCC11和B·CCGMCC12，采用亞硝酸鈉的質(zhì)量濃度分別在20～40和40～60 mg/L的誘變劑量更為適合。誘變劑量過大，出發(fā)菌株致死率過高(90%～100%)，因為高劑量的亞硝酸鈉會導致細菌大量基因嚴重損傷，這些基因的功能得不到及時修復就會造成負突變長生；小劑量進行處理，致死率為30%～60%，在單位存活細胞中正突變株多，然而挑選出大幅度提高產(chǎn)量的菌株可能性較小。

2.4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)

出發(fā)菌株在亞硝酸鈉誘變處理后，必然破壞了其DNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使突變位點可能處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，增大了回復突變或抑制基因突變的概率。為保證突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，在誘變育種過程中做一段長期的培養(yǎng)和觀測，反復傳代7次觀測其性狀穩(wěn)定性。鋁硅酸鹽礦物的微生物風化破壞程度與細菌產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外多聚物(主要為蛋白質(zhì)與多糖)等代謝產(chǎn)物的能力密切相關(guān)。細菌代謝產(chǎn)生的有機酸對增加硅酸鹽礦物的溶解度和釋放硅、鋁、鐵等有顯著促進作用；由細菌分泌的胞外聚合物而形成的生物膜可以為微生物獲取礦物中的營養(yǎng)元素提供十分有利的微環(huán)境，這是影響硅酸鹽礦物風化的關(guān)鍵因素之一；多糖等黏性代謝產(chǎn)物的絡(luò)合功能有利于細菌-礦物復合體的形成，這有助于提高微生物對礦物的機械破壞作用和代謝產(chǎn)物對礦物的化學溶蝕作用。在浸礦與硅酸鹽礦物微生物風化實驗中發(fā)現(xiàn)，Bacillus mucilaginosus等“硅酸鹽”細菌會產(chǎn)生一定量的有機酸與大量的胞外聚合物，使風化培養(yǎng)液的pH值小幅下降，而黏度大幅度的增加。

為此，以細菌代謝產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物為誘變菌株的另兩個重要正突變指標，對經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)后所挑選出來的誘變菌株B·MCGMCC11KP，B·CCGMCC12KP與出發(fā)菌株在各菌株的最佳生理生化條件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)體系中的pH 值與黏度，進一步考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，測定結(jié)果見圖5。黏度可以初步衡量細菌產(chǎn)大分子胞外聚合物的能力。

由圖5可知，誘變菌株B·CCGMCC12KP 和B·MCGMCC11KP的產(chǎn)酸與產(chǎn)大分子胞外聚合物的能力明顯要比誘變前的強，且達到最大量的發(fā)酵時間更短。在發(fā)酵培養(yǎng)到第5 d和第6 d時，B·MCGMCC11KP發(fā)酵液中的黏度和pH 值分別到達最大與最低值，為512 mPa·s 和 4.7，而相對應(yīng)的出發(fā)菌株的最大黏度與最低pH 值分別為490 mPa·s 和 5.2，且所需時間比前者分別延時了4和2 d；B·CCGMCC12KP的發(fā)酵液在第7 d 達到最大黏度(510 mPa·s)和最低pH值(5.0)，而B·CCGMCC12的發(fā)酵液則分別延時了2和1 d后到達最大黏度(470 mPa·s)和最低pH值(5.4)。由以上結(jié)果可以進一步推斷，出發(fā)菌株經(jīng)亞硝酸鈉誘變后引起了遺傳變異，篩選所得到的突變菌株產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的能力較出發(fā)菌株有了較大的提高，其中誘變菌株B·MCGMCC11K產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的能力最強。

圖5 發(fā)酵體系中B·C CGMCC12與B·M CGMCC11誘變前后黏度與pH值的變化規(guī)律Fig. 5 Changes of viscosity (a) and pH values(b) of B·C CGMCC12 and B·M CGMCC11 before and after NIT-induced mutagenesis

2.5 鋁土礦細菌浸出效果

以無菌培養(yǎng)液作為對照(CK)，采用單一與組合菌種的形式，選用出發(fā)菌株B·CCGMCC12 和B·MCGMCC11 與誘變菌株B·CCGMCC12KP 和B·MCGMCC11KP浸出鋁土礦，試驗結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，在整個浸出過程中，各浸出體系的上清液中SiO2的浸出質(zhì)量濃度的變化規(guī)律一致，大致可以分為持續(xù)快速增加期、平緩增加期與停滯期3個階段，但在不同的浸出體系中，SiO2的質(zhì)量濃度的增加幅度與時間跨度存在明顯差異。

圖6 不同浸出體系中SiO2的質(zhì)量濃度隨浸出時間的變化Fig. 6 Change of SiO2 concentrations with leaching time in different systems: (a) CK; (b) B·M CGMCC11; (c) B·M CGMCC12; (d) B·M CGMCC11KP; (e) B·C CGMCC12KP; (f)B·M CGMCC11+B·C CGMCC12(1:1); (g) B·M CGMCC11KP+B·C CGMCC12KP(1:1)

在接種了出發(fā)菌株B·MCGMCC11 和B·CCGMCC12的浸出體系中，上清液中SiO2的浸出質(zhì)量濃度隨浸出時間的變化規(guī)律一致。在0～10 d，浸出體系上清液中SiO2的質(zhì)量濃度持續(xù)快速增加，從0 mg/L分別增加至41.25和35.60 mg/L；在10～15 d，SiO2的質(zhì)量濃度平緩增加至42.66和37.2 mg/L；試驗中發(fā)現(xiàn)，15 d 后，菌種對鋁土礦的溶蝕作用才基本停止，SiO2的質(zhì)量濃度不再增加，達到浸出終點。

在接種了誘變菌株B·CCGMCC12KP的浸出體系中，上清液中SiO2的浸出質(zhì)量濃度的快速增加期、平緩增加期與停滯期3個階段分別為0～9 d、9～12 d 和12～15 d。當浸出到第12 d 時，浸出液中SiO2的浸出質(zhì)量濃度為48 mg/L左右，且隨浸出時間的延長不再增加，達到浸出終點。

在接種了誘變菌株B·MCGMCC11KP的浸出體系中，對應(yīng)的3個浸出階段分別為0～8 d、8～10 d和10～15 d。浸出10 d 后，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度隨浸出時間的延長而增加的幅度十分微弱，可以認為浸出到第10 d 時已經(jīng)達到浸出終點，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度為55 mg/L左右。

在 接 種 了 誘 變 前 的B·MCGMCC11+B·CCGMCC12(數(shù)量比為 1:1)的混合浸出體系中，對應(yīng)的3個浸出階段與誘變前單一菌株浸礦體系的一致，達到浸出終點(15 d)時，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度為51 mg/L左右。這一結(jié)果表明混合菌種的浸礦溶硅效果要比單一菌種的要好。

在 接 種 了 誘 變 菌 株B·MCGMCC11KP+B·CCGMCC12KP(數(shù)量比為1:1)的混合浸出體系中，對應(yīng)的3個浸出階段分別為0～8 d、8～9 d和10～15 d。根據(jù)浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度隨浸出時間的變化幅度，可以認為在浸出到第9 d 時，浸出體系已經(jīng)達到浸出終點，此時浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度為66 mg/L左右。

從以上試驗結(jié)果可以看出：出發(fā)菌株B·MCGMCC11的浸礦脫硅效果要稍好于出發(fā)菌株B·CCGMCC12的浸礦效果，結(jié)合它們產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的能力結(jié)果(見圖5)，說明代謝能力是影響細菌對礦物溶蝕與分解的關(guān)鍵因素之一；誘變菌株B·MCGMCC11KP 和B·CCGMCC12KP對鋁土礦的脫硅率明顯比對應(yīng)的出發(fā)菌株要高，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度分別提高了 30.47%和 29.57%，且達到浸出終點的時間分別提前了5和3 d，說明出發(fā)菌株經(jīng)亞硝酸鈉誘變后，引起了生物變異，使出發(fā)菌株的鋁土礦脫硅性能得到了較大的提高；使用兩種菌的混合浸礦效果大于兩種菌單獨浸礦效果，其中，在接種了誘變菌株B·MCGMCC11KP+B·CCGMCC12KP 的混合浸出體系中，達到浸出終點的時間比出發(fā)菌株提前了6 d，比浸礦效果較好的誘變菌株B·MCGMCC11KP提前了1 d，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度分別比單一誘變菌株B·MCGMCC11KP 和B·CCGMCC12KP提高了20.0% 和37.5% 左右，說明混合浸出是一個相互促進過程。

2.6 浸渣表面分析

鋁土礦對照樣(CK)及不同浸礦體系中浸渣表面的SEM與XRD 的檢測結(jié)果見圖7 和8。

圖8 浸出7 d后不同浸出體系中鋁土礦浸渣的XRD譜Fig. 8 XRD patterns of bauxite surfaces after leaching for 7 d in different systems: (a) CK; (b) B·M CGMCC11; (c) B·M CGMCC11KP; (d) B·M CGMCC11KP+B·C CGMCC12KP(1:1)

由圖7可知，與未經(jīng)細菌處理的鋁土礦對照樣(見圖7(a))比較，各浸出體系中鋁土礦浸渣表面均有明顯的變化，且不同浸出體系造成的浸渣表面的溶蝕程度不同。未經(jīng)細菌作用的鋁土礦對照樣表面較為光滑平整，表面有少量的細小顆粒(見圖7(a))；出發(fā)菌株B·MCGMCC11 和B·CCGMCC12 作用后的鋁土礦表面溶蝕程度基本一致，表面粗糙不平，小顆粒被溶蝕，出現(xiàn)了大量裂縫與棱角分明的較大顆粒，鋁土礦表面結(jié)構(gòu)被基本破壞(見圖 7(b)和(c))；誘變菌株B·MCGMCC11KP作用后的鋁土礦表面原始結(jié)構(gòu)的破壞程度較出發(fā)菌株更加顯著，溶蝕量明顯增加，表面出現(xiàn)了大量溶蝕坑，細小顆粒明顯增多，顆粒之間呈絮狀粘連(見圖7(d))；誘變菌株B·CCGMCC12KP作用后的礦樣表面的溶蝕程度較B·MCGMCC11KP作用后的鋁土礦表面溶蝕程度略小，浸渣表面有大量的溶蝕帶與圓滑的細小顆粒(見圖 7(e))；在誘變菌株B·MCGMCC11KP+B·CCGMCC12KP的混合浸出體系中，鋁土礦表面的溶蝕量最大，現(xiàn)象最為明顯，鋁土礦表面原始結(jié)構(gòu)被完全破壞，看不到明顯的單獨細小顆粒，顆粒之間基本呈絮狀粘連到一起(見圖7(f))。

從圖8可以看出，與對照組比較，在3組浸出體系中，細菌對鋁土礦中的高嶺石、伊利石、綠泥石、赤鐵礦和針鐵礦均有明顯的溶蝕與分解作用，各自特征峰的衍射銳鋒強度均有不同程度的降低或消失。混合誘變菌株B·MCGMCC11KP+B·CCGMCC12KP 的浸出體系對鋁土礦的分解作用最為明顯，浸出終點后，鋁土礦中的高嶺石、伊利石與赤鐵礦特征峰基本消失，而石英的特征銳鋒明顯增強；單一誘變菌株B·MCGMCC11KP的浸出體系明顯要比單一出發(fā)菌株B·MCGMCC11的浸出體系對鋁土礦的風化分解作用要強，高嶺石、伊利石、綠泥石、赤鐵礦和針鐵礦特征峰下降更為明顯。 從圖8還可以看出，細菌對具有層狀結(jié)構(gòu)的高嶺石與伊利石的分解作用明顯要大于具架狀結(jié)構(gòu)的石英，表明該類細菌對鋁土礦中的硅酸鹽礦物的風化分解具有一定的選擇性。

2.7 鋁土礦細菌浸出后浸出液中生物群落組成

在細菌浸出反應(yīng)的初始階段，誘變前后的B·MCGMCC11和B·CCGMCC12具有相同的細胞濃度。浸出15 d 后，在接種了誘變前混合菌B·MCGMCC11 +B·CCGMCC12的浸礦體系中，經(jīng)過限制性片斷長度多態(tài)性(ARDRA)分析，浸出液中B·MCGMCC11和B·CCGMCC12的數(shù)量比約為13:1；在相同條件下，接種了誘變后混合菌B·MCGMCC11KP +B·CCGMCC12KP 的浸出礦體系中，它們的數(shù)量比約為10∶1。這證明了B·C不是浸礦過程的優(yōu)勢菌，只占菌落結(jié)構(gòu)的小部分，協(xié)助B·M起浸礦促進作用。因此，可以在以后的鋁土礦浸礦脫硅研究中更多考慮有利于B·M浸礦的因素，并在浸出體系中接種少量的B·C。

3 結(jié)論

1) 試驗中所選用的出發(fā)菌株B·MCGMCC11生長的最佳pH 值為7.2，最適溫度為28 ℃；出發(fā)菌株B·CCGMCC12生長的最適 pH 值為8.3，最適溫度為30 ℃。

2) 亞 硝酸 鈉 誘 變B·MCGMCC11 和B·CCGMCC12的最佳劑量分別為40和60 mg/L，致死率分別為87% 和85%，正突變率分別為18% 和20%。誘變后篩選所得的誘變菌株B·MCGMCC11KP和B·CCGMCC12KP 達到生長穩(wěn)定期的時間分別比對應(yīng)的出發(fā)菌株縮短了48和24 h，且有更大的細菌濃度；誘變菌株產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的能力較出發(fā)菌株有了較大的提高，其中誘變菌株B·MCGMCC11K產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外聚合物的能力最強。

3) 誘 變 菌 株B·MCGMCC11KP 和B·CCGMCC12KP對鋁土礦溶蝕分解能力比對應(yīng)的出發(fā)菌株要強，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度分別比出發(fā)菌株提高了30.47% 和29.57%，且達到浸出終點的時間分別提前了5和3 d；混合誘變菌株優(yōu)于單獨出發(fā)菌株、單獨誘變菌株和混合出發(fā)菌株對鋁土礦的風化分解效果，浸出體系達到浸出終點的時間比出發(fā)菌株提前了6 d，比浸礦效果較好的誘變菌株B·MCGMCC11KP提前了1 d，浸出液中SiO2的質(zhì)量濃度分別比單一誘變菌株B·MCGMCC11KP和B·CCGMCC12KP提高了20.0%和37.5% 左右。

4) 在鋁土礦混合浸礦過程中，B·M與B·C相比，B·M為浸礦過程中的優(yōu)勢菌，浸出 15 d后，B·MCGMCC11和B·CCGMCC12 數(shù)量比由 1∶1 變?yōu)?13∶1左右；而B·MCGMCC11KP 和B·CCGMCC12KP 數(shù)量比由1∶1變?yōu)?0∶1左右。

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