孟 迪，劉愛民，馬曉艷，盧 瑋

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130041）

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，死亡率高達(dá)70%，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命安全。隨著腫瘤細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)，缺氧已經(jīng)廣泛存在于惡性腫瘤的微環(huán)境之中。腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的途徑往往是通過提高糖酵解的速率及形成多血管體系，而缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）是促進(jìn)糖酵解和血管生成的重要因子，因此HIF－1α在惡性腫瘤血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中起到重要作用［1］。目前，卵巢癌的化療療效并不十分理想，致使卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊不前，因此，如何提高卵巢癌化療的敏感性成為治療卵巢癌的關(guān)鍵，也成為臨床上迫切需要解決的問題。本研究應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，選擇 HIF－1α基因作為靶點(diǎn)，抑制人卵巢癌細(xì)胞HIF－1α的基因表達(dá)，為增加卵巢癌化療的敏感性提供了新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料 SKOV3（人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株）購自上海研晶生物公司，由吉大二院中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。質(zhì)粒pSilencer2.1－U6－neo和 MTT 試劑購自Sigma公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自科克美（北京）生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，HIF－1α單克隆抗體購自上海博古生物公司，工具酶購自百奇生物，胎牛血清購自Hyclone公司，質(zhì)粒小提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司，順鉑為江蘇豪森藥業(yè)產(chǎn)品，DH5α購自克勞寧北京生物公司，凋亡試劑盒購自南京百奧生物科技有限公司，所需寡核苷酸序列由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 HIF－1αsiRNA 載體構(gòu)建 針對(duì) HIF－1α基因mRNA，選擇一段特異性堿基序列作為干擾靶點(diǎn)，編碼發(fā)卡RNA的雙鏈雙鏈寡核普酸序列：Forward 5’－GATGAGAACATGTCACCTTTT CAAGTTCCTTGTCAGTGAGATTGGAAGTCCAGATTGCTCTGACA－3’，Rreverse 3’－GTAGGTCTCAGTGACCTTGAAAGTTTCTCTTCAAGGTCACTGAGACCTAAAAAAACAGCTGTTCGA－5’。模板鏈的兩端引入HindⅢ和BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。采用無同源性序列的無目標(biāo)siRNA作陰性對(duì)照。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 DNA片段退火后將質(zhì)粒 pSilencer2.1－U6－neo雙酶切（HindⅢ，BamHⅠ），T4連接酶連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α（感受態(tài)大腸埃希菌），涂于LB培養(yǎng)基上，24h后隨機(jī)挑取菌落，接種在LB培養(yǎng)液中振蕩12h，采用堿裂解法提取質(zhì)粒并定量。將SKOV3細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)（4X105/孔），用含10%胎牛血清的 RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合達(dá)到80%－90%時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，改用含20%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。采用G418抗性篩選14天，獲得已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞（穩(wěn)定存活）。實(shí)驗(yàn)分3組：空白組（SKOV3），非特異對(duì)照組（SKOV3NS），目的siRNA組（SKOV3siRNA）三組。

1.2.3 RT－PCR 檢測(cè) HIF－1αmRNA 表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定其濃度和純度，經(jīng)RT反應(yīng)獲取cDNA，根據(jù)人HIF－1α基因cDNA序 列，進(jìn) 行 PCR 引 物 設(shè) 計(jì)：HIF－1α－upper：5’－CCCATCACACATGTAAGTTAGATC－3’；HIF－1α－lower： 5’－TGGAGAAGTTGCTAATGGAGTAG－3 ’。 β－actin－upper： 5 ’－CATGCCTCTGCTTTCTGTCA－3’；β－actin－lower：5’－TCACCTCTTGTCAGCTGTG－3’。分別在相同條件下以HIF－1α和內(nèi)對(duì)照β－actin的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，53℃退火45s，73℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳，染色、照相后進(jìn)行圖像灰度差異分析。

1.2.4 Western Blot法檢測(cè)HIF－1α蛋白表達(dá) 消化并收集細(xì)胞后提取總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離蛋白，將膠樣電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，12h后5%脫脂奶封閉，加入HIF－1α單克隆抗體（1∶1000）4℃過夜，0.1%Tween－PBS洗膜3次（10min/次），邊洗邊搖，加入二抗過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG（1∶5 000），室溫1h后PBST重復(fù)洗膜3次，ECL發(fā)光壓片顯色，曝光后圖片掃描分析結(jié)果。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將三組細(xì)胞消化后分別制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中（4×104/孔），每孔體積200μl，培養(yǎng)液中加入順鉑（終濃度為20μmol/L［2］），各組設(shè)有自身不加 DDP的復(fù)孔作為空白對(duì)照。37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)72h，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20 μL，37℃溫育4－6h，1 000r/min離心5min后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150μL/孔，振蕩10min，使甲臜充分溶解，選擇490nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值（A值），記錄結(jié)果。細(xì)胞抑制率＝（1－加藥組平均A值/空白對(duì)照組平均A值）×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)（FCS）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用胰酶消化法重懸經(jīng)順鉑作用后的各組細(xì)胞，制備各組單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，加入5μl Annexin V－FITC和15μl碘化丙啶，避光室溫反應(yīng)20min。離心機(jī)上1 000rpm，離心5min后棄上清，加入200μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10μl碘化丙靛染色液，輕輕混勻。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR檢測(cè) HIF－1αmRNA表達(dá)結(jié)果 見圖1，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，進(jìn)行圖像灰度分析，空白組、非特異對(duì)照組和目的siRNA組細(xì)胞HIF－1αmRNA檢測(cè)結(jié)果分別為0.535±0.071、0.472±0.083和0.316±0.085。與兩對(duì)照組相比，目的siRNA組細(xì)胞HIF－1αmRNA表達(dá)水平明顯降低，P值分別為0.005和0.008，提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白組與非特異對(duì)照組兩組細(xì)胞比較，HIF－1αmRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.725）。

圖1 細(xì)胞HIF－1αmRNA PCR檢測(cè)圖

2.2 Western Blot法檢測(cè)HIF－1α蛋白結(jié)果 見圖2。空白組、非特異對(duì)照組和目的siRNA組細(xì)胞HIF－1α蛋白檢測(cè)結(jié)果分別為0.551±0.094、0.573±0.082和0.339±0.092。與兩對(duì)照組相比，目的siRNA組細(xì)胞HIF－1α蛋白表達(dá)明顯降低，P值分別為0.028和0.014，提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而空白組與非特異對(duì)照組比較，細(xì)胞HIF－1α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.652）。

圖2 細(xì)胞HIF－1α蛋白Westem blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞抑制率結(jié)果 經(jīng)順鉑作用后，空白組、非特異對(duì)照組和目的siRNA組細(xì)胞抑制率分別為0.456±0.127、0.431±0.136和0.721±0.114。與兩組對(duì)照組相比，目的siRNA組細(xì)胞抑制率明顯增加，P值分別為0.014和0.018，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而空白組與非特異對(duì)照組比較，P＝0.865，提示細(xì)胞抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果 見圖3。經(jīng)順鉑作用后，空白組、非特異對(duì)照組和目的siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為19±3、19±2和36±3。與兩對(duì)照組相比，目的siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯增加，P值為別分0.001和0.002，提示差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而空白組與非特異對(duì)照組比較，P＝0.862，提示細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 細(xì)胞凋亡FCS檢測(cè)圖

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）是一種調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)和保持氧穩(wěn)態(tài)平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在低氧環(huán)境下，能夠通過活化下游靶基因，使腫瘤細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解增加，促進(jìn)局部新生血管的生成來恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而適應(yīng)乏氧微環(huán)境，因此，HIF－1α在惡性腫瘤血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中均起到重要的作用。Wong等實(shí)驗(yàn)研究［3］表明，在正常人類組織中并未檢測(cè)到HIF－1α蛋白的表達(dá)，而在多種人體惡性腫瘤組織中則存在著HIF－1α蛋白的表達(dá)顯著增高，且隨著腫瘤分期及惡性程度的增高，HIF－1α蛋白表達(dá)也呈明顯增高趨勢(shì)［4，5］。因此，HIF－1α可以作為評(píng)價(jià)早期卵巢癌侵襲能力的重要生物學(xué)標(biāo)記物，降低卵巢癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子－1α的表達(dá)對(duì)抑制卵巢癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移具有重要意義。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是指將雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入目的細(xì)胞中，其中的一條單鏈與靶mRNA特異性結(jié)合后將其降解，并引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS），從而表現(xiàn)出細(xì)胞特定基因缺失的表型。RNAi技術(shù)與其他轉(zhuǎn)錄后基因治療方法相比，可通過降解靶基因并以自身作為引物進(jìn)行合成，通過兩種方式瀑布式地增殖，短時(shí)間內(nèi)能夠高效地抑制靶基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染siRNA48h后即可看到明顯的靶基因表達(dá)抑制率高于90%。同時(shí)，siRNA能夠?qū)Π谢虬l(fā)揮較特異性的抑制作用，其堿基序列與靶基因的mRNA序列能達(dá)到完全匹配，siRNA其中任何一個(gè)堿基發(fā)生改變，均不能與靶基因相結(jié)合，從而導(dǎo)致RNA干擾失敗。Brummelkamp等研究［6］表明，siRNA表達(dá)載體可以長(zhǎng)期并穩(wěn)定地抑制目的基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)，表明siRNA技術(shù)沉默基因具有高效性和特異性，siRNA技術(shù)能夠?yàn)榛蛑委熖峁┝艘粋€(gè)有效的工具。

化療在卵巢癌的臨床治療中占有重要地位，化療的療效直接影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間，如何提高卵巢癌的化療敏感性成為臨床上迫切需要解決的問題。順鉑（DDP）是臨床上治療卵巢癌常用的化療藥物之一，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可以在抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制過程的同時(shí)損傷其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤作用。DDP具有類似烷化劑雙功能基團(tuán)的作用，進(jìn)入細(xì)胞后水解為陽離子水化物，并與腫瘤細(xì)胞DNA鏈上的堿基發(fā)生作用，改變其作為正常模版的功能，引起DNA復(fù)制障礙，從而抑制癌細(xì)胞分裂。

目前，卵巢癌的化療療效并不十分理想，致使卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊不前，因此，如何提高卵巢癌化療的敏感性成為治療卵巢癌的關(guān)鍵，也成為臨床上迫切需要解決的問題。基于上述已有的科學(xué)技術(shù)研究成果，本研究選擇HIF－1α基因作為靶點(diǎn)，將載體系統(tǒng)引入卵巢癌細(xì)胞中，并使之長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)以沉默HIF－1α基因，通過RNA干擾技術(shù)有效地下調(diào)了卵巢腫瘤細(xì)胞中HIF－1α基因和蛋白的表達(dá)水平，誘導(dǎo)和促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的凋亡，在分子水平上阻斷了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為卵巢癌基因治療與化學(xué)治療相結(jié)合提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步提高卵巢癌患者的生存率提供一條新的治療途徑。

［1］劉亦晴，張建文，陳奎生，等.皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌組織中 HIF－1α、VEGF的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，42（2）：340.

［2］王勇梅，吳維光，葛紅雨，等.沉默STAT3基因?qū)θ寺殉舶┗熋舾行缘挠绊懀跩］.中國癌癥雜志，2010，20（4）：270.

［3］Wong Ch，Theresa L，Karen H，et al.VEGF and HIF－1expression are increased in sdvanced stages of epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2003，91（3）：513.

［4］Shimogai R，Kigawa J，Itamochi H，et al.Expression of hypoxiainducible factor 1alpha gene affects the outcome inpatients with ovarian cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2008，18（3）：499.

［5］Argyriou P，Papageorgiou S G，Panteleon V，et al.Hypoxiainducible factors in mantle cell lymphoma：implication for anactivatedmTORC1→HIF－1αpathway［J］.Ann Hematol，2011，90（3）：315.

［6］Brummelkamp TR，BernardsR，AgamiR.A ststem for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］.Science，2002，296（5567）：550.