曾頌，李書(shū)淵，吳志堅(jiān)，黃玉梅，陳艷芬*，楊全，陳偉民，蘇彬

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市藥材公司 中藥飲片廠，廣東 廣州 510360)

半夏鎮(zhèn)咳祛痰的成分-效應(yīng)關(guān)系研究△

曾頌1，李書(shū)淵1，吳志堅(jiān)2，黃玉梅2，陳艷芬1*，楊全1，陳偉民1，蘇彬1

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市藥材公司 中藥飲片廠，廣東 廣州 510360)

目的：基于灰色關(guān)聯(lián)法評(píng)價(jià)半夏主要成分與鎮(zhèn)咳祛痰效應(yīng)之間的關(guān)系，為半夏質(zhì)量控制的指標(biāo)選擇提供依據(jù)。方法：測(cè)定生半夏及其炮制品中3種主要成分(生物堿、多糖、有機(jī)酸)的含量，運(yùn)用小鼠鎮(zhèn)咳、祛痰藥理模型評(píng)價(jià)半夏不同炮制品的藥效，采用灰色關(guān)聯(lián)法將兩者數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，評(píng)價(jià)半夏鎮(zhèn)咳祛痰的成分與效應(yīng)之間的關(guān)系。結(jié)果：與半夏鎮(zhèn)咳祛痰作用關(guān)聯(lián)的成分關(guān)聯(lián)度大小排序依次為：生物堿>多糖>有機(jī)酸。結(jié)論：半夏中總生物堿與鎮(zhèn)咳祛痰作用的相關(guān)性最大，初步確認(rèn)可以生物堿為指標(biāo)建立半夏藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

半夏；成分；藥理效應(yīng)；灰色關(guān)聯(lián)法

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品[1]，歷代本草均有收載，為我國(guó)常用毒性中藥[2]。半夏味辛，性溫，有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)功能，用于濕痰寒痰，咳喘痰多，痰飲眩悸，風(fēng)痰眩暈，痰厥頭痛，嘔吐反胃，胸脘痞悶，梅核氣；外治癰腫痰核[3]。研究表明半夏的主要有效成分總游離有機(jī)酸具有止咳化痰、止嘔功效，并對(duì)胃癌細(xì)胞有抑制作用[4]；半夏總生物堿有止嘔和抗炎作用，其總生物堿含量高低直接影響藥材的質(zhì)量和療效[5]；半夏多糖有抗腫瘤作用，它具有激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)活性[6]，可抑制腫瘤的發(fā)生和增殖[7]，并且具有清除羥自由基的能力[8]。本研究運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)法評(píng)價(jià)半夏中生物堿、有機(jī)酸、多糖與半夏傳統(tǒng)功效之間的關(guān)系，篩選合理的指標(biāo)成分，為建立評(píng)價(jià)半夏藥材質(zhì)量的方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

生半夏(批號(hào)：S20111020，產(chǎn)地：四川，廣州市藥材公司中藥飲片廠)。法半夏(批號(hào)：F20111020)；清半夏(批號(hào)：Q20111020)；姜半夏(批號(hào)：J20111020)，分別由同一批次生半夏依照《中國(guó)藥典》2010版一部“法半夏”、“清半夏”、“姜半夏”項(xiàng)下制法炮制而成。經(jīng)廣東藥學(xué)院李書(shū)淵教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。取以上各樣品粉末200 g，加入8倍量的水，煎煮，保持微沸1 h后，紗布濾過(guò)，得濾液，濃縮待用，給藥前配制成每1 mL含生藥0.15 g的混懸液。

陽(yáng)性對(duì)照藥：鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)采用枸櫞酸噴托維林片(規(guī)格：25 mg/片，長(zhǎng)春迪瑞制藥有限公司，批號(hào)：100101)，實(shí)驗(yàn)時(shí)配成1.67 mg·mL-1；祛痰實(shí)驗(yàn)采用羧甲司坦片(廣州白云山制藥股份有限公司，批號(hào)：1103041)，實(shí)驗(yàn)時(shí)配成25 mg·mL-1。

D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200503)；鹽酸麻黃堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0090-9801)。

1.2 主要試劑

苯酚紅(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑中心，批號(hào)：200402025)；氯化鈉(分析純，天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20100420)；碳酸氫鈉(化學(xué)純，廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：20060613)；氨水(分析純，廣州化學(xué)制劑廠，批號(hào)：20110401-1)；98%濃硫酸(分析純，北京化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20120506)；苯酚(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120207)；95%乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司，批號(hào)：20120706)；三氯甲烷(分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20120502-2)；溴百里香酚藍(lán)指示劑(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)：20110406)。

1.3 儀器

Techcomp MaxTitra 30M自動(dòng)電位滴定儀(大連天美科學(xué)儀器有限公司)；SHIMADZU，UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)；Sartorious，BP211D十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯)；SHIMADZU，AY120萬(wàn)分之一電子天平(日本島津)；飛鴿牌TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；WH-2000輕便型超聲霧化器(廣東粵華醫(yī)療器械廠)。

1.4 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用KM小鼠，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，正常飼養(yǎng)3 d后供試。

2 方法與結(jié)果

2.1 有機(jī)酸、生物堿和多糖的含量測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2010版一部“半夏”項(xiàng)下“含量測(cè)定”方法，采用電位滴定法，對(duì)生半夏及其炮制品的有機(jī)酸進(jìn)行含量測(cè)定[3]；以鹽酸麻黃堿為對(duì)照品，采用酸性染料比色法，測(cè)定吸光度，按照回歸方程計(jì)算含量，對(duì)生半夏及其炮制品的生物堿進(jìn)行含量測(cè)定[9]；以D-無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，采用硫酸-苯酚法顯色后用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，對(duì)生半夏及其炮制品的多糖進(jìn)行含量測(cè)定，按照回歸方程計(jì)算含量[10]。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 生半夏及其炮制品有機(jī)酸、總生物堿、總多糖的含量n=5) /%

2.2 半夏不同炮制品的鎮(zhèn)咳祛痰實(shí)驗(yàn)

2.2.1 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)方法[11]，取KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。各實(shí)驗(yàn)組每日灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d。末次給藥1 h后，將小鼠置于氨水引咳裝置中制備咳嗽模型。噴霧15 s，立即取出小鼠，記錄引咳潛伏期和3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，見(jiàn)表2。

2.2.2 祛痰實(shí)驗(yàn) KM小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。各實(shí)驗(yàn)組每日灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d，末次給藥30 min后，小鼠腹腔注射0.5%酚紅0.9%氯化鈉溶液，0.2 mL·(10g)-1，注射30 min后脫臼處死，然后小鼠仰位固定于手術(shù)板上，剪開(kāi)頸正中皮膚，分離氣管，以注射器吸取5% NaHCO3溶液0.5 mL推注入氣管內(nèi)，通過(guò)針頭來(lái)回灌洗呼吸道3次，收集灌洗液，2 000 r·min-1離心5 min，取上清液，采用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)558 nm測(cè)定其光密度(OD值)，根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其酚紅濃度，見(jiàn)表2。

從表2結(jié)果可見(jiàn)，與空白對(duì)照組比較，半夏各種制品不同程度延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生半夏、姜半夏、法半夏均可減少小鼠咳嗽次數(shù)，姜半夏還能明顯增加氣管酚紅排泌量，具有祛痰作用。

表2 生半夏及其炮制品的鎮(zhèn)咳祛痰作用n=12)

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度方法

2.3.1 參考序列的選擇 設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)含量評(píng)價(jià)指標(biāo)，即組成子序列{Xki}，(i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=4，m=3)。其中，“咳嗽潛伏期”和“酚紅排泌量”與供試藥物效力(有效成分含量)為正相關(guān)關(guān)系；而“咳嗽次數(shù)”與供試藥物效力(有效成分含量)為負(fù)相關(guān)關(guān)系，故先將“咳嗽次數(shù)”的值轉(zhuǎn)化為倒數(shù)化像。定義藥理指標(biāo)“潛伏期”、“咳嗽次數(shù)”、“酚紅排泌量”為母序列{Xoi}，依次分別為{Xoi}潛，{Xoi}咳和{Xoi}酚(i=1，2，3……n)。

2.3.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理 由于評(píng)價(jià)指標(biāo)間存在測(cè)度單位不統(tǒng)一和各含量指標(biāo)間獨(dú)立性的問(wèn)題，且需要將負(fù)相關(guān)因素轉(zhuǎn)化為正相關(guān)因素，因此需要將子序列和母序列的原始數(shù)據(jù)按公式(1)進(jìn)行處理，見(jiàn)表3。

表3 子序列和母序列數(shù)據(jù)規(guī)格化

2.3.3 計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù) 經(jīng)數(shù)據(jù)規(guī)格化后的母序列記為{Yoi}，子序列記為{Yki}，則母序列{Yoi}與子序列{Yki}的關(guān)聯(lián)系數(shù)Loki，可由公式(2)計(jì)算，見(jiàn)表4～6。

Loki=(Δmin+ρΔmax)/(Δoki+ρΔmax)

(2)

式中Loki表示兩比較序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)；Δoki=|Yoi-Yki|(1≤i≤n)；Δmin和Δmax分別表示兩比較序列中差的絕對(duì)值中的最小值與最大值。因?yàn)楸容^序列相交，故取Δmin=0；ρ稱(chēng)為分辨系數(shù)，其意義是削弱最大差的絕對(duì)值太大引起的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性，ρ∈(0，1)，本研究選取0.8。關(guān)聯(lián)系數(shù)反映兩個(gè)被比較序列的靠近程度。

表4 相對(duì)于潛伏期{Xoi}潛母序列的各關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算結(jié)果

表5 相對(duì)于咳嗽次數(shù){Xoi}咳母序列的各關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算結(jié)果

表6 相對(duì)于酚紅排泌量{Xoi}酚母序列的各關(guān)聯(lián)系數(shù)計(jì)算結(jié)果

2.3.4 計(jì)算關(guān)聯(lián)度 按公式(3)計(jì)算，見(jiàn)表7。

(3)

ri(o)為子序列{Xki}與母序列{Xoi}的關(guān)聯(lián)度，n為比較序列的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)。ri(o)愈大，表明子序列與母序列的關(guān)聯(lián)程度愈甚，對(duì)藥理效應(yīng)的貢獻(xiàn)就越大。

表7 相對(duì)于各母序列的關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)度排序

3 討論

灰色關(guān)聯(lián)度分析來(lái)自灰色系統(tǒng)理論。其基本思想是一種相對(duì)性的排序分析，根據(jù)序列曲線幾何形狀的相似程度來(lái)判斷其聯(lián)系是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似關(guān)聯(lián)度越大，反之則越小，由此從所考察的復(fù)雜系統(tǒng)中找出主次因素，為系統(tǒng)綜合決策及提高綜合效益提供信息。也就是說(shuō)兩者在發(fā)展過(guò)程中相對(duì)變化基本一致，則認(rèn)為兩者關(guān)聯(lián)度大，反之，兩者關(guān)聯(lián)度小。設(shè)有n個(gè)中藥樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)特征量化指標(biāo)，這樣構(gòu)成了m個(gè)子序列。以樣品藥效學(xué)指標(biāo)作為母序列，依據(jù)母序列與子序列關(guān)聯(lián)度的大小，可確定諸特征對(duì)藥效貢獻(xiàn)的大小[12-13]。

基于灰色關(guān)聯(lián)度法的思想，本研究通過(guò)測(cè)定炮制前后半夏中3種有效成分有機(jī)酸、生物堿和多糖的含量，并進(jìn)行鎮(zhèn)咳祛痰的藥理作用評(píng)價(jià)，建立以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，將成分的含量測(cè)定結(jié)果與藥理作用評(píng)價(jià)結(jié)果相聯(lián)系，從而研究半夏藥材中對(duì)傳統(tǒng)功效貢獻(xiàn)大的成分，為選擇指標(biāo)成分提供依據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果關(guān)聯(lián)度排序大小，生物堿均排在第一位，確定半夏藥材中生物堿對(duì)鎮(zhèn)咳祛痰作用貢獻(xiàn)程度最大。綜上所述，本研究初步認(rèn)為可以生物堿為指標(biāo)性成分建立半夏藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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Ingredients-effectRelationshipStudyonAntitussiveandExpectorantofPinelliaeRhizoma

ZENG Song1，LI Shu-yuan1，WU Zhi-jian2，HUANG Yu-mei2，CHEN Yan-fen1*，YANG Quan1，CHEN Wei-min1，SU Bin1

(1.(SchoolofChinesemedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou，510006，China；2.GuangzhouMateriaMedicaCompany，Guangzhou510360，China)

Objective:To study ingredients-effect relationship of Pinelliae Rhizoma by the Grey incidence degree method，and provide the basis for the indicators of its quality control.Methods：Gray Model was sated up by quantitating the three main ingredients(alkaloids，polysaccharides，and organic acids)and using the antitussive and expectorant pharmacological model to evaluate the effects of Pinelliae Rhizoma and its processed products.Results：The size sort of Grey incidence degree associated with antitussive and expectorant ingredients：alkaloids>organic acids>polysaccharides.Conclusion：As to antitussive and expectorant effect，alkaloids were the most effective ingredient，which could be recognized as indicator for Pinelliae Rhizoma quality control.

Pinelliae Rhizoma； Ingredient； Pharmacologic effect； Grey incidence degree method

2013-01-08)

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廣州市荔灣區(qū)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(20114813042)，廣東藥學(xué)院2012年校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

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陳艷芬，Tel:(020)39352180，E-mail：xwnai@163.com