于澤洋，于 濤，趙長福，王志申

（吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春130033）

骨折愈合是一個極其復雜的骨再生過程。其修復的過程就是正常胚胎骨發(fā)生過程的重演，是一系列的細胞和細胞外基質的變化過程。骨折愈合機制受到機體及局部環(huán)境的多層面、多途徑的調節(jié)，在不同的愈合階段有不同的細胞參與，且有許多生長因子表達水平的改變，從而影響骨折愈合速度［1－3］。

神經營養(yǎng)因子（neurot rophic factors，NTFs）是由多種細胞所分泌的一類對中樞和外周神經系統(tǒng)發(fā)揮營養(yǎng)作用的非常規(guī)營養(yǎng)物質，通常為大分子蛋白質或小分子肽類物質［4］。它們可調節(jié)細胞的生長分化，促進和支持靶細胞的存活、生長及發(fā)育，調節(jié)神經系統(tǒng)的代謝和功能活動，它們對神經系統(tǒng)疾病及神經系統(tǒng)損傷后的再生修復也有著重要作用。

近來，隨著研究的深入，不斷地發(fā)現(xiàn)有新的種類的神經營養(yǎng)因子。目前關于它們的分類及歸屬仍不十分明確，研究比較集中的主要有神經生長因子（nerve growth factor，NGF），腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurot rophic factor，BDNF），神經營養(yǎng)素（neurot rophin，NTs），睫狀神經營養(yǎng)因子（ciliary neurot rophic factor，CNTF），膠質源性神經營養(yǎng)因子（glial derived neurot rophic factor，GDNF），胰島素樣生長因子（insulin－like growth factor，IGF），轉化生長因子（transforming growth factor，TGFs），成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。

對骨折愈合中神經營養(yǎng)因子表達的研究表明，骨痂形成過程中有多種NTFs表達，包括BDNF，NGF和神經營養(yǎng)因子23（NT23）。骨形成細胞有NTFs受體trkA 和trkC的表達［5－7］，提示 NTFs涉及骨形成的調節(jié)，但機制不清。目前已知，NGF對骨折修復的研究始于Eppley等人，他們在應用NGF修復兔下頜神經缺損的實驗中，不僅證實NGF能促進神經軸突再生，同時發(fā)現(xiàn)在再生軸突周圍有新生類骨質生成［8］。BDNF是NTFs家族中重要成員，是由神經元的靶細胞分泌，逆向營養(yǎng)神經元，對神經系統(tǒng)具有廣泛作用，尤其可以促進感覺神經元譜系分化，維持運動神經元的存活，對神經細胞的生長發(fā)育及保護修復有重要作用，其作用范圍甚至超過NGF。在骨折愈合過程中，神經支配和調節(jié)也有著明顯的影響。腦外傷病人骨折愈合較快；此外，一些神經疾病患者的骨骼外成骨量也較多。

因此，本實驗圍繞神經因素應用于干細胞工程與骨組織工程的可行性方面，從體外實驗，對神經營養(yǎng)因子與骨形成的關系進行討論。探討骨折修復作用中BDNF對骨髓間充質干細胞的成骨細胞誘導分化、損傷修復的作用。證實神經營養(yǎng)對骨形成的作用，為神經營養(yǎng)因素應用于骨組織工程種子細胞研究打下基礎。

1 材料和方法

1．1 pECFP－C1－BDNF重組質粒載體的構建

EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切已構建的pUCm－T－BDNF質粒及pECFP－C1質粒，瓊脂糖電泳鑒定后回收純化目的片段。T4DNA連接酶作用下將測序正確的BDNF基因片段與雙酶切后的載體質粒4℃連接過夜。轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。小量抽提質粒，EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ兩種雙酶切方案進行鑒定。

1．2 大鼠骨髓間充質干細胞的提取與培養(yǎng)

無菌條件下獲取的大鼠骨髓，吹打制成均勻的細胞懸液。將骨髓細胞懸液加于Percoll淋巴細胞分離液液面上（2∶1比例）。3 000rpm離心10min。去上清，吸取中間白膜層，加入PBS清洗2遍。1 800 r／min，離心10min。用含10%FBS的L－DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，計數，將細胞密度調至2×106／ml，接種于25mm2培養(yǎng)瓶中。置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每隔3d換液。

原代細胞長至80%－90%匯合時，進行傳代培養(yǎng)。胰酶消化后，加入含10%FCS的L－DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，按1∶2比例傳代接種培養(yǎng)。

1．3 pECFP－C1－BDNF質粒轉染骨髓間充質干細胞

將細胞等量分到6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔約5×105個／ml，直至細胞密度約80%左右時進行轉染。將FuGENE HD轉染試劑、無血清和抗生素的培養(yǎng)液恢復至室溫。轉染試劑與質粒以3∶2的比例混合。轉染48h后收集細胞，以相應的未經轉染的細胞或轉染相應的空質粒的細胞作為陰性對照。Western Blot檢測轉染后BMSCs BDNF的表達。

1．4 骨髓間充質干細胞向成骨細胞的誘導及鑒定

取P4代BMSCs，細胞正常消化，接種于6孔板內，接種密度為1×104個／ml，正常培養(yǎng)24h。轉染pECFP－C1－BDNF質粒48h后，然后更換成骨誘導培養(yǎng)基，每2－3天換液一次，連續(xù)誘導3周。Von Kossa染色。將成骨誘導后的細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，95%乙醇室溫固定10min；放入2%硝酸銀，置于強光處作用15－60min；蒸餾水沖洗3遍，2%硫代硫酸鈉還原1h；流水沖洗5min，1%伊紅復染5min，沖洗，顯微鏡觀察。

1．5 Western Blot檢測

收集各組細胞總蛋白。制備12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠，取100μg總蛋白上樣，電泳1．5h；室溫、恒壓220V條件下，半干轉移法轉膜1h。PBST配制的5%脫脂奶粉溶液用作封閉液，室溫封閉1h；兔抗BDNF多克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜；PBST漂洗3次，每次10min；加入HRP－抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，PBST 洗3次，每次10min；PBS洗膜10min；ECL反應3min后，暗室中X光片曝光；室溫顯影、定影。用凝膠成像系統(tǒng)對膠片進行薄層密度掃描，記錄相應條帶的透射光積分光密度（IOD）值反映蛋白含量。

1．6 堿性磷酸酶的檢測

經重組質粒pECFP－C1－BDNF轉染的細胞與未轉染的細胞分別制成5×104個／孔的密度，鋪于24孔板中，每孔1ml，檢測堿性磷酸酶含量的變化情況。以未轉染的細胞作對照。采用堿性磷酸酶定量檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中堿性磷酸酶的含量。

2 結果

2．1 pECFP－C1－BDNF重組質粒載體的構建

pUCm－T－BDNF克隆后經EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切后得到BDNF基因目的片段，回收純化測序結果正確無突變或缺失。重組質粒pECFP－C1－BDNF經EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ兩種雙酶切方案鑒定、測序后得出相同結果（見圖1．A，B）。

2．2 骨髓間充質干細胞的分離和培養(yǎng)

倒置顯微鏡下觀察，原代細胞接種24h后，部分細胞貼壁，貼壁細胞呈長梭型。接種3d后，長梭形細胞增多（圖2．A）。培養(yǎng)5d左右，細胞胞體變大呈典型成纖維細胞樣，大量細胞向外放射狀生長，細胞排列整齊，克隆顯著增多并融合成片。原代細胞培養(yǎng)7－10d左右即可傳代。培養(yǎng)在25cm2培養(yǎng)瓶中，第3代以上的細胞按1∶2比例傳代6d可長至80%左右，第20代左右的細胞按1∶3比例傳代僅3d可達90%以上匯合。

圖1 A：pECFP－C1－BDNF重組質粒經EcoRⅠ／SalⅠ酶切鑒定。B：pECFP－C1－BDNF經EcoRⅠ／BamHⅠ酶切鑒定

圖2 人骨髓間充質干細胞形態(tài)圖

2．3 pECFP－C1－BDNF質粒轉染骨髓間充質干細胞

熒 光 顯 微 鏡 下 可 見 pECFP－C1－BDNF 轉 染BMSCs效率可達80%左右（圖3．A，B）。Western blot檢測結果顯示，pECFP－C1－BDNF轉染BMSCs 48h表達分子量約為30kD的融合蛋白條帶（圖3．C）。

圖3 A，B：pECFP－C1－BDNF重組質粒轉染BMSCs。C：Western blot檢測pECFP－C1－BDNF轉染BMSCs后BDNF蛋白表達。

2．4 轉染pECFP－C1－BDNF質粒的BMSCs向成骨細胞誘導分化

轉染pECFP－C1－BDNF與未轉染質粒的BMSCs組均加入成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞誘導成骨培養(yǎng)5－8天后，細胞有長梭形逐漸變成多角形或不規(guī)則狀，并且體積增大。誘導21天后，有鈣結節(jié)產生。鈣結節(jié)的形成為成骨細胞特有。我們利用Von kussa染色礦化結節(jié)的經典方法，細胞鈣結節(jié)的主要成分鈣鹽與硝酸銀復分解形成可被還原的銀鹽，在強光或式紫外光下生成黑色金屬銀。因此在染色結束后，粉紅色背景上有黑色顆粒的產生。

隨機16個視野中觀察，結果發(fā)現(xiàn)轉染pECFPC1－BDNF質粒組，細胞鈣結節(jié)的Von kussa染色黑色顆粒含量和范圍都較未轉染質粒組的多，初步證明了，轉染pECFP－C1－BDNF質粒后BMSCs向成骨細胞誘導分化的效率比未轉染質粒的BMSCs較高。BDNF在細胞中的表達有利于BMSCs向成骨細胞的誘導分化。

圖4 轉染pECFP－C1－BDNF質粒的BMSCs向成骨細胞誘導分化后鈣結節(jié)形成的Von kussa染色圖

2．5 堿性磷酸酶合成變化

當誘導培養(yǎng)至第9天時，轉染重組質粒組BMSCs細胞與未轉染組細胞堿性磷酸酶含量與對照組比較均顯著升高。未轉染組細胞堿性磷酸酶含量為（4．78±0．30）IU／ml；而轉染的BMSCs細胞堿性磷酸酶含量為（5．88±0．19）IU／ml。提示pECFP－C1－BDNF轉染BMSCs細胞后，BDNF蛋白的表達使細胞更易于向成骨細胞誘導分化，使細胞所分泌的堿性磷酸酶量呈顯著性升高（P＜0．05）。

圖5 轉染pECFP－C1－BDNF質粒后BMSCs向成骨細胞誘導時堿性磷酸酶合成含量的變化

3 討論

骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復反應，是成骨細胞、破骨細胞及其他多種細胞和細胞因子參與的復雜過程。骨折不同的愈合階段有不同的細胞及細胞因子參與，骨形成過程受多種因素調控［5－7］。

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內除造血干細胞之外的一類具有多向分化潛能的成體干細胞，是骨髓基質的重要組成成分［9－11］。在一定的誘導條件下，BMSCs具有向成骨細胞，軟骨細胞，神經細胞，脂肪細胞，心肌細胞等多向分化的能力，并可通過分泌一些可溶解因子，如腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF），bFGF和睫狀神經營養(yǎng)因子（CNTF）等促進神經再生。BMSCs由于具有多分化潛能，容易在體外擴增，容易轉染等特點而成為基因治療的良好靶細胞。BMSCs已經在眾多臨床前期實驗中被用于修復各種組織損傷。已有研究表明，骨折治療中，導入NGF－BMSC，不僅能誘導BMSC向成骨細胞轉變，它分泌的NGF還能加速骨折愈合，從而達到更理想的效果。Eppley等發(fā)現(xiàn)，NGF具有骨折修復的潛能［8，12，13］。

BDNF是NTFs家族中重要成員，是由神經元的靶細胞分泌，逆向營養(yǎng)神經元，對神經系統(tǒng)具有廣泛作用，尤其可以促進感覺神經元譜系分化，維持運動神經元的存活，對神經細胞的生長發(fā)育及保護修復有重要作用，其作用范圍甚至超過NGF。

本實驗成功構建了真核表達質粒pECFP－C1－BDNF。在研究中發(fā)現(xiàn)，轉染pECFP－C1－BDNF質?？梢杂行У脑贐MSCs內表達BDNF蛋白，并且加速BMSCs向成骨細胞的誘導分化的進程，有利用BMSCs在骨損傷部位分化為成骨細胞，促進骨折愈合，對骨折后損傷部位的組織修復等具有重要的作用。本研究對BDNF基因修飾型細胞移植治療臨床疾病提供了一條有效、安全的新的發(fā)展方向。

［1］Grills BL，Schuijers JA，Ward AR．Topical application of nerve growth factor improves fracture healing in rats［J］．J Orthop Res，1997，15（2）：235．

［2］Brian L Grills，Johannes A Schuijers，Alex R Ward．Topical Application of Nerve Growth Factor Improves Fracture Healing in Rats［J］．The Journal of Bone and Joint Surgery，1997，15：35．

［3］Asaumi K，Nakanishi T，Asahara H，et al．Expression of neurotrophins and their receptors（TRK）during fracture healing［J］．Bone，2000，26（6）：625．

［4］Frostick SP，Yin Q，Kemp GJ．Schwann cells，neurotrophic factors and peripheral nerve regeneration［J］．Microsurgery，1998，18：397．

［5］Maisonpierre PC，Belluscio L，F(xiàn)riedman B，et al．NT－3，BDNF，and NGF in the developing rat nervous system：Parallel as well as reciprocal patterns of expression［J］．Neuron，1990，5：501．

［6］Sasaki M，Radtke C，Tan AM，et al．BDNF－h(huán)ypersecreting human mesenchymal stem cells promote functional recovery，axonal sprouting，and protection of corticospinal neurons after spinal cord injury［J］．J Neurosci，2009，29（47）：14932．

［7］Koyama R，Yamada MK，F(xiàn)ujisawa S，et al．Brain－derived neurotrophic factor induces hyperexcitable reentrant circuits in the dentate gyrus［J］．J Neurosci，2004，24（33）：7215．

［8］Eppley BL，Snyders RV，Winkelmann TM，et al．Efficacy of nerve growth factor in regeneration of the mandibular nerve：apreliminary report［J］．J Oral Maxillofuc Sur，1991，49：61．

［9］Liechty KW，MacKenzie TC，Shaaban AF，et al．Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate sitespecific differentiation after in utero transplantation in sheep［J］．Nat Med，2000，6：1282．

［10］Westerlund U，Moe MC，Varghese M，et al．Stem cells from the adult human brain develop into functional neurons in culture［J］．Exp Cell Res，2003，289：378．

［11］Tondreau T，Lagneaux L，Dejeneffe M，et al．Bone marrowderived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation［J］．Differentiation，2004，72：319．

［12］Woo－Kie Min，Jae－Sung Bae，Byung－Chul Park，et al．Proliferation and osteoblastic differentiation of bone marrow stem cells：comparison of vertebral body and iliac crest［J］．Eur Spine J，2010，19（10）：1753．

［13］Zhou Zhi－lin，Sun Jun，Zhao Yu，et al．Expression of recombinant coexpression plasmid of pIRES－h(huán)VEGF121cDNA／hBMP－4in bone marrow mesenchymal stem cells and its effects on osteogenic differentiation．Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering［J］．Research，2010，49（14）：1368．