張 偉，董 理

（1．長春市中心醫(yī)院，吉林 長春130051；2．中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院）

多發(fā)性骨髓瘤 （multiple myeloma，MM）是常見漿細胞克隆性異常增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。其臨床特點是進行性的骨質(zhì)破壞。臨床表現(xiàn)骨痛、高鈣血癥、病理性骨折、彌漫性骨質(zhì)疏松等［2］。復(fù)發(fā)病例再次化療組與對照組治療無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由耐藥性所引起的，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后［3］。本文通過測序檢測多發(fā)性骨髓瘤患者MDR1基因＋3435C／T的單核苷酸多態(tài)；應(yīng)用Kaplan－Meier來確認 MDR1基因＋3435C／T的單核苷酸多態(tài)性對患者生存期的影響及MDR1基因＋3435C／T對硼替佐咪治療的多發(fā)性骨髓瘤者預(yù)后的影響。

1 對象與方法

1．1 對象 長春市中心醫(yī)院骨科及血液科2008至2011年經(jīng)病理證實的多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)本89例。單純手術(shù)治療組45例，中位年齡60（40－76）歲，硼替佐咪化療治療組44例，中位年齡67（50－84）歲。

1．2 方法 從組織樣本中提取全基因組DNA，通過PCR檢測MDR1基因rs1045642序列。PCR引物： Forward：5′－CTTCGGAACGCTAAGAACAAACT－3′ 23bp； Reverse：5′－TCTGAGGTCTTCTCTCTGAAATC－3′23bp。

產(chǎn)物大小為：328bp［4］。PCR擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，首先95℃變性30 s；然后按53℃復(fù)性40s；接著72℃延伸45s，循環(huán)33次后72℃延伸10min。產(chǎn)物通過軟件Chromas處理。經(jīng)測序公司測序在＋3435位點發(fā)現(xiàn)C／T單核苷酸基因多態(tài)性。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS17．0統(tǒng)計學(xué)處理，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0．05作為有無顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過Kaplan－Meier方法以存活時間為非獨立變量，來檢驗當(dāng)控制某一層因素后對其他研究因素不同水平的生存時間比較的影響分別進行分析，存活期的組間比較應(yīng)用差異顯著性log－rank檢驗（生存期為患者第一次手術(shù)為起始）。

2 結(jié)果

2．1 MDR1基因序列分析

腫瘤進展機制研究提示，人群中不同個體之間的基因存在差異性或多態(tài)性，可能與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在89例骨髓瘤患者中，檢測MDR1基因rs1045642＋3435位點的多態(tài)性，47例患者（52．8%）為 ＋3435C／T基因型，氨基酸改變?yōu)長1145M，比有些報道要高；42例患者（47．2%）為 ＋3435T／T型。并未檢測出＋3435C／C基因型，測序見表1。

表1 C／T單核甘酸多態(tài)性測序結(jié)果

2．2 MDR1＋3435C／T基因狀態(tài)對多發(fā)性骨髓瘤患者生存期的影響

89例骨髓瘤患者的平均生存期為40．4月。接受手術(shù)治療的患者（n＝45）的平均生存期為38．2月，接受硼替佐咪治療的患者（n＝44）的平均生存期為42．8月（P＜0．05）。硼替佐咪治療的患者預(yù)后效果較好，這與文獻結(jié)果一致［5］。檢測 MDR1＋3435C／T基因型患者的平均生存期為43．3月，MDR1＋3435T／T基因型患者的平均生存期為37．5月（P＝0．024）。MDR1＋3435位點C／T基因型似乎對多發(fā)性骨髓瘤患者的生存期影響更大。（各組生存期見表2）

表2 89例患者經(jīng)硼替佐咪治療與手術(shù)治療后的生存期（月）

2．3 MDR1＋3435C／T基因狀態(tài)對經(jīng)硼替佐咪治療的多發(fā)性骨髓瘤患者生存期的影響

在44例經(jīng)硼替佐咪治療的患者的樣本中，有22例為MDR1＋3435C／T基因型，22例是 MDR1＋3435T／T基因型，其平均生存期分別為46．2月和39．3月（P＝0．041）。數(shù)據(jù)顯示 MDR1＋3435位點CT基因型對硼替佐咪用藥患者的生存期有顯著的影響。（各組生存期見表2）

3 討論

骨髓瘤是成人最常見的惡性腫瘤，是具侵襲性的腫瘤，診斷為多發(fā)性骨髓瘤的患者，平均生存期小于3年［6］。

骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素的結(jié)果，具體發(fā)病機制不完全清楚［7］，骨髓細胞向瘤細胞的轉(zhuǎn)變也是一個復(fù)雜的過程。實驗表明有很多基因和蛋白參與了這一過程，導(dǎo)致細胞周期發(fā)生變化、信號傳導(dǎo)通路異常，從而導(dǎo)致細胞增殖和血管增生的異常，在骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到一定作用［8］。

干細胞治療是骨髓瘤最有效方法，化療是重要的輔助治療手段，對放療敏感的患者，化療也是很好的聯(lián)合方法［9］。硼替佐咪雖然臨床應(yīng)用后反應(yīng)良好［10］，同其他化療藥物一樣，多發(fā)性骨髓瘤對硼替佐咪也易產(chǎn)生耐藥性。目前研究認為CYP2C19基因和MDR1基因功能在對抗硼替佐咪耐藥有一定作用［11］。本研究提示 MDR1＋3435位點C／T基因型似乎對多發(fā)性骨髓瘤患者的生存期影響更大。在44例接受硼替佐咪治療的患者樣本中，MDR1＋3435位點C／T基因型患者（n＝22）與 MDR1＋3435位點T／T基因型患者（n＝22）兩組樣本量相對平衡，發(fā)現(xiàn)兩組生存期統(tǒng)計學(xué)有顯著差異（P＝0．041）。在89例骨髓瘤患者的研究中，MDR1＋3435位點C／T基因型患者占52．8%，高于之前的研究［12］，不能排除這種高頻性的表型由樣本數(shù)量較少或種族差異所引起的。

在少量樣本中，MDR1＋3435C／T基因型的作用效果可能不能充分顯示，然而相對平衡的數(shù)據(jù)卻有利于對患者生存期的分析。在小樣本研究中，MDR1＋3435位點C／T基因型的影響并沒有完全體現(xiàn)在患者的存活上。

［1］Sanford S，Deborshi R，Schindler M．Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumors［J］．Proc Natl Acad Sci，1994，91：349．

［2］Fletcher JI，Haber M，Henderson MJ，et al．ABC transporters in can－cer：more than just drug efflux pumps［J］．Nat Rev Cancer，2010，10（2）：147．

［3］Coley HM．Overcoming multidrug resistance in cancer：clinical studies of p－glycoprotein inhibitors［J］．Methods Mol Biol，2010，596：341．

［4］Ma P，Dong X，Swadley CL，et al．Development of idarubicin and doxorubicin solid lipid nanoparticles to overcome Pgp－mediated multiple drug resistance in leukemia［J］．J Biomed Nanotechnol，2009，5（2）：151．

［5］Borst P，Evers R，Kool M，Wijnholds J．The multidrug resistance protein family［J］．Biochim Biophys Acta，1999，1461（2）：347．

［6］Johnstone RW，Ruefli AA，Smyth MJ．Multiple physiological functions formultidrug transporter P－glycoprotein［J］？Trends Biochem Sci，2000，25（1）：1．

［7］Pavek P，F(xiàn)endrich Z，Staud F．Physiologic function of P－glycoprotein［J］．Cesk Fysiol，2002，51（3）：99．

［8］Zhu BT．A novel hypothesis for the mechanism of action of P－glycoprotein as amultidrug transporter［J］．Mol Carcinog，1999，25（1）：1．

［9］Chaudhary PM，Mechetner EB，Roninson IB．Expression and activity of themulti drug resistance P－glycoprotein in human peripheral blood lymphocytes［J］．Blood，1992，80：2735．

［10］Grogan TM，Spier CM，Salmon SE，Matzner M，Rybski J，et al．P－glycoprotein expression in human plasma cell myeloma：correlation with prior chemo therapy［J］．Blood，1993，81：490．

［11］Wuchter C，Leonid K，Ruppert V，et al．Clinical significance of P－glycoprotein expression and function for response to induction chemotherapy，relapse rate and overall survival in acute leukemia［J］．Haemato logica，2000，85（7）：711．

［12］Yamaguchi M，Mizutani M，Miwa H，et al．P－glycoprotein expression in hematological malignancies［J］．Rinsho Ketsueki，1995，36（6）：567．