王偉潔，李紅梅，薛 芳，陳寶珍，高露嬌

（1上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

胸苷磷酸化酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，并參與細(xì)胞核酸代謝途徑，在“補(bǔ)救途徑（salvage path）”中可催化脫氧胸苷可逆磷酸化反應(yīng)，提供脫氧核糖-1-磷酸，釋放堿基胸腺嘧啶，加入另一種堿基形成新的核苷。在生物合成核苷藥物中具有重要作用[1-2]。

核苷磷酸化酶產(chǎn)生菌主要有大腸桿菌、乙酰短桿菌、歐文桿菌、干燥棒桿菌以及佐氏庫(kù)特氏菌等[1]。關(guān)于酶法合成核苷類藥物的報(bào)道很多。如沈榮坤等[3]以大腸桿菌為酶源，利用胸腺嘧啶和2'-脫氧核苷合成胸苷；李喻等[4]利用乙酰短桿菌為酶源，胸苷和鳥苷酸為底物，2'-脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化率高達(dá)56.4%；洪云海等[5]利用乙酰短桿菌為酶源，胸苷和腺嘌呤為底物，2'-脫氧腺苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá) 65.6%。目前利用含有核苷磷酸化酶的菌株合成核苷類藥物的轉(zhuǎn)化率均較低，其關(guān)鍵問題在于菌株含酶量很少，因此如何提高菌體含酶量從而提高單位菌體酶活以提高生物催化轉(zhuǎn)化的效率是全細(xì)胞催化研究的重點(diǎn)。

從文獻(xiàn)調(diào)研看，提高含酶量最有效最快捷方法主要是通過改良微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)基。以正交試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面方法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法為代表的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法廣泛地應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化工作中，取得了顯著的成果[6]。本研究將首次以實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的短乳桿菌作為產(chǎn)胸苷磷酸化酶菌種，將Placket-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)區(qū)域以及采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)相結(jié)合對(duì)短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)核苷及其衍生物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[7]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

短乳桿菌為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH值7.0～7.2。

（2）活化液 酵母膏10.0 g/L，自然pH值。

（3）初始發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2 培養(yǎng)條件

將短乳桿菌接種在固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ跓o菌環(huán)境下從斜面培養(yǎng)基上挑取兩環(huán)菌體接種到裝液量為50 mL的250 mL錐形瓶活化液中，在36 ℃搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min條件下活化10～12 h。然后以一定的接種量接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在搖床轉(zhuǎn)速為 110 r/min、36 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3 分析方法

1.3.1 濕菌體的制備

將培養(yǎng)好的菌體4000 r/min離心15 min，去除上清液后，再用pH值為7.3的無菌磷酸緩沖液沖洗兩次，離心，得到濕菌體冷藏備用。

1.3.2 胸苷磷酸化酶活測(cè)定方法——紫外分光光度法

據(jù)Saunders等報(bào)道[8]，采用分光光度法測(cè)定反應(yīng)生成的胸腺嘧啶來表征產(chǎn)酶量。標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)混合液包含一定濃度的濕菌體，25 mmol/L的胸苷，1 mmol/L的EDTA，pH值為7.3、50 mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液。55 ℃條件下反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在沸水中煮沸5 min終止反應(yīng)，離心去除沉淀。上清液用pH值為12的NaOH溶液稀釋100倍，然后測(cè)定290 nm的紫外吸光度OD290nm的增值[9]。胸苷磷酸化酶酶活單位定義為：在上述條件下，1 min內(nèi)OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的一個(gè)酶活力單位[12]。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

1.4.1 PB設(shè)計(jì)

選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、葡萄糖、酵母膏、NaCl、蛋白胨和胸苷作為PB設(shè)計(jì)的10個(gè)因子，具體設(shè)計(jì)和分析方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的一次多項(xiàng)式確定最陡爬坡方向，以此逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.4.2 CCD實(shí)驗(yàn)

根據(jù)PB設(shè)計(jì)以及最陡爬坡試驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)因素和水平，進(jìn)行了三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，通過 Design Expert 8.0完成試驗(yàn)設(shè)計(jì)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4.3 SDS-PAGE電泳分析

按照優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)發(fā)酵并收集濕菌體，采用酶解-超聲耦合法破碎濕菌體制備胸苷磷酸化酶液，具體方法如下：將濕菌體按照一定濃度稀釋，在300 μg/mL的溶菌酶液下37℃酶解1.5 h，隨后將酶解液在450 W功率下超聲破碎處理12次（超聲40 s/間歇20 s），最后將破壁后的菌液在轉(zhuǎn)速為 13 000 r/min，4 ℃低溫離心 30 min，收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett—Burrman 設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)酶的重要因素

在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蛋白胨和底物胸苷對(duì)胸苷磷酸化酶酶活有一定的促進(jìn)作用，因此結(jié)合文獻(xiàn)資料，選取初始葡萄糖、酵母膏、NaCl、蛋白胨、胸苷、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度作為PB設(shè)計(jì)的10個(gè)因素（X1、X2、X4、X5、X7、X8、X9、X11、X12、X13），具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，使用minitab15.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方差分析其結(jié)果見表2。

從變量的效應(yīng)可看出初始pH值、發(fā)酵溫度、酵母膏、NaCl和胸苷對(duì)短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶有正效應(yīng)，轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間、接種量、葡萄糖和蛋白胨顯示出負(fù)效應(yīng)。在置信區(qū)間95%之中，接種量、發(fā)酵時(shí)間和葡萄糖濃度相比其它因素而言對(duì)系統(tǒng)的響應(yīng)值影響較為顯著，因此確定選擇發(fā)酵時(shí)間、接種量和葡萄糖濃度 3個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種量、發(fā)酵時(shí)間和葡萄糖具有負(fù)效應(yīng)，因此可通過降低接種量、發(fā)酵時(shí)間和葡萄糖濃度來提高產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力。其它因素的取值則根據(jù)正效應(yīng)的因素取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。結(jié)合實(shí)際需要，對(duì)影響顯著的 3個(gè)重要因素的步長(zhǎng)進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)，具體取值及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，2號(hào)培養(yǎng)基的胸苷磷酸化酶活最高1.008 U/mg，從3號(hào)開始，胸苷磷酸化酶活明顯降低，因而選用2號(hào)所對(duì)應(yīng)的因素水平作為后續(xù)中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.4 響應(yīng)面擬合及最優(yōu)條件的確定

根據(jù)PB設(shè)計(jì)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素及水平，采用“Design Expert 8.0”的中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)3因素的CCD實(shí)驗(yàn)，以胸苷磷酸化酶活為響應(yīng)值，取5個(gè)水平，以（?1.682，?1，0，1，1.682）編碼，中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)為6，設(shè)計(jì)20組實(shí)驗(yàn)[11]，實(shí)驗(yàn)水平及編碼值見表4，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表5中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到胸苷磷酸化酶活對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、接種量和葡萄糖濃度的擬合線性回歸方程如式（1）。

Y為短乳桿菌濕菌體胸苷磷酸化酶酶活的預(yù)測(cè)值；A、B、C分別為培養(yǎng)時(shí)間、接種量和葡萄糖濃度的編碼值。由表6可知，該模型極顯著（p=0.0004），在研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合較好，并能作出較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)[10]。求回歸方程式（1）得模型極值點(diǎn)坐標(biāo)：A=10.57 h，B=1.54%，C=18.00 g/L，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的最大值為1.152 U/mg。由圖1可直觀地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，每個(gè)響應(yīng)圖分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第3個(gè)變量保持在0水平。

2.5 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳培養(yǎng)條件下，做5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到胸苷磷酸化酶活為1.172 U/mg，基本與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大1.152 U/mg符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的較好。在初始發(fā)酵條件，短乳桿菌濕菌體胸苷磷酸化酶活為0.400 U/mg，優(yōu)化后提高了2.93倍。

2.6 SDS-PAGE分析

將優(yōu)化前和優(yōu)化后獲得的濕菌體破胞離心獲得的酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，優(yōu)化前后胸苷磷酸化酶濃度如圖2所示。文獻(xiàn)資料顯示，微生物體內(nèi)含有三類核苷磷酸化酶，分別是嘌呤磷酸化酶（2.582×104）、尿苷磷酸化酶（2.8×104左右）及胸苷磷酸化酶（4.3×104左右）[12]。從圖中可以看出，在三類核苷磷酸化酶中只有胸苷磷酸化酶分子量條帶（胸苷磷酸化酶相對(duì)分子質(zhì)量4.3×104）高于優(yōu)化前，其它兩種核苷磷酸化酶的生產(chǎn)情況卻未得到改善，因此可以避免在全細(xì)胞生物催化轉(zhuǎn)化的過程中由于嘌呤磷酸酶和尿苷磷酸化酶利用內(nèi)源性底物合成非目標(biāo)核苷類物質(zhì)，從而影響胸苷磷酸化酶合成的目標(biāo)產(chǎn)物的分離。

表4 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼值

表5 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3 結(jié) 論

微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的種類、各組分濃度及培養(yǎng)條件均會(huì)影響微生物代謝過程中產(chǎn)酶量。從文獻(xiàn)調(diào)研看，盡管胸苷磷酸化酶存在于許多微生物體內(nèi)，但目前關(guān)于短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶的研究鮮有報(bào)道。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)胸苷磷酸化酶短乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件得出以下結(jié)論。

表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析

圖1 培養(yǎng)時(shí)間、接種量、葡萄糖濃度影響胸苷磷酸化酶活的響應(yīng)面圖

（1）在傳統(tǒng)的以酵母膏，葡萄糖以及氯化鈉培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加一定濃度的蛋白胨和胸苷能有效促進(jìn)短乳桿菌分泌胸苷磷酸化酶。

（2）在發(fā)酵培養(yǎng)條件方面，通過優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，提高發(fā)酵溫度和采用偏堿性的pH值等（未優(yōu)化前采用32 ℃，pH 值為7.0）更有利于提高短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶。

圖2 SDS-PAGE分析短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶能力

（3）優(yōu)化后確定最佳培養(yǎng)基配方為：酵母膏15 g/L，NaCl 7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，胸苷15mmol/L，葡萄糖18 g /L。發(fā)酵條件為：pH值8.0，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，發(fā)酵溫度38 ℃，培養(yǎng)時(shí)間10.57 h，接種量 1.54%。在上述優(yōu)化條件下，胸苷磷酸化酶活試驗(yàn)驗(yàn)證值達(dá)到1.172 U/mg，與優(yōu)化前相比，酶活提高了2.93倍。

（4）采用蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方案僅能提高單位濕菌體中胸苷磷酸化酶的含量。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化短乳桿菌產(chǎn)胸苷磷酸化酶發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件是一種可行有效的方法。要進(jìn)一步提高胸苷磷酸化酶活，還需在菌種選育（物理化學(xué)誘變、基因組重排技術(shù)等）、代謝調(diào)控以及擴(kuò)大化培養(yǎng)條件等方面繼續(xù)研究。

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