王芳妹，楊子劍，韓 梅，胡 翔，丁小鳳*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，中國長沙 410081;2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，中國長沙 410007)

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種骨髓造血干細(xì)胞惡性增殖的造血系統(tǒng)腫瘤，約占全部白血病的20%左右.90%以上的慢性粒細(xì)胞白血病具有Ph染色體和BCR-ABL染色體易位融合基因的表達(dá)，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞持續(xù)升高和脾臟顯著腫大［1］.CML的病程可分為慢性期、加速期和急變期.目前可能徹底治療慢性粒細(xì)胞白血病的方法是移植造血干細(xì)胞，但是可供者來源有限［2］.常規(guī)化學(xué)藥物和生物制劑IFN治療的不良反應(yīng)大.近年來，分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼為數(shù)萬例CML患者顯著延長早慢性期和IFN-α治療失敗的晚慢性期.但伊馬替尼對于未分化的白血病干細(xì)胞無效，容易導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)且持續(xù)治療費(fèi)用高［3-4］.

阿司匹林是一種非甾體抗炎藥，主要用于解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和抗血小板凝集，預(yù)防冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病發(fā)作.近來研究發(fā)現(xiàn)長期小劑量服用阿司匹林可以降低多種癌癥的發(fā)病率［5］.阿司匹林顯著抑制結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6-9］.動物實驗證明阿司匹林可以使人結(jié)腸腫瘤縮小到15%，而沒有任何副作用［10］.阿司匹林對慢性粒細(xì)胞白血病的治療研究卻少有報道.本研究探討阿司匹林對人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株的抑制作用，并初步分析可能的分子機(jī)制，為白血病的臨床治療提供新的實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株為本實驗室保存.3～4周BALb/c品系雌性裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司.DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于GIBCO公司.四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst 33258和阿司匹林購于Sigma公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自 Fermentas公司.鼠抗 β-catenin、STAT5A、PARP、NF-κB p65和p21單克隆抗體購于Santa Cruz公司，鼠抗GAPDH單克隆抗體購于湖南遠(yuǎn)泰生物公司.Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒購于美國BD公司.SuperSignal ECL發(fā)光試劑盒購于Pierce公司.其他常規(guī)試劑均購于上海生工公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人慢性粒細(xì)胞白血病K562半懸浮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1.667 mkat/L(即105U/L)青霉素、1.667 mkat/L(即105U/L)鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3 K562細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

分別用0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理的K562細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照.將余下的細(xì)胞離心收集于1.5 mL離心管，加入0.5 mL多聚甲醛(40 g/L)，緩緩懸起細(xì)胞，固定10 min.用PBS洗2遍.將細(xì)胞滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻.稍晾干，均勻滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min.用PBS洗2遍.蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核.每組實驗重復(fù)3次.

1.4 細(xì)胞增殖分析

1.4.1 MTT法 K562細(xì)胞在24孔板上培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別加入適當(dāng)?shù)乃幬锾幚?4 h和48 h.加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h后，離心，棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，水平漩渦器振蕩使結(jié)晶完全溶解，測定每孔波長490 nm的吸光值.每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次.

1.4.2 細(xì)胞計數(shù)法 將1×109個/L的K562細(xì)胞接種6孔板中，分別加入0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h和48 h.將細(xì)胞用臺盼藍(lán)溶液染色，用計數(shù)板于低倍顯微鏡下計算各組細(xì)胞的密度.每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次.

1.4.3 軟瓊脂克隆形成實驗 K562細(xì)胞經(jīng)0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h并加入含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM的0.35%瓊脂培養(yǎng)基，每孔2 000個細(xì)胞，共設(shè)3個平行組，輕輕轉(zhuǎn)動6孔板使細(xì)胞分散均勻.置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d.在低倍顯微鏡下計數(shù)大于30個細(xì)胞的克隆數(shù)，數(shù)碼相機(jī)拍照.每組至少重復(fù)3次實驗.

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

K562細(xì)胞經(jīng)0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理36 h，收集細(xì)胞(每組至少1×106個細(xì)胞)，采用Annexin V-FITC/PI染色后上機(jī)操作，以未染色細(xì)胞進(jìn)行機(jī)器調(diào)零，分別以Annexin V-FITC和PI單染管作為基準(zhǔn)參照，測定每組細(xì)胞的數(shù)據(jù)，顯示凋亡細(xì)胞的百分比.每組至少重復(fù)3次實驗.

1.6 裸鼠成瘤實驗

將1×107個細(xì)胞接種于8只BALb/c裸鼠背部皮下，接種后每天觀察荷瘤小鼠的生長情況，當(dāng)瘤體長到1 cm3左右，選取4只瘤體體積相同的裸鼠進(jìn)行腹腔注射給藥，實驗組給予25 mg/kg的阿司匹林，對照組給予0.1 mL生理鹽水，各組每兩天測瘤體體積和給藥1次，連續(xù)2周.末次給藥24 h后以脫臼法將裸鼠處死，取出皮下移植瘤，稱重和拍照.每組實驗重復(fù)2次.

1.7 Western 印跡

收集0、10、20和30 mmol/L阿司匹林處理K562細(xì)胞36 h的蛋白裂解物，SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5 mL含脫脂奶粉50 g/L的TBS緩沖液中封閉1 h.加入一抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育2 h，TTBS洗膜，5 min×4次.加入羊抗鼠二抗(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育45 min，TTBS洗膜，5 min×4 次，ECL顯色，拍照分析.

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗組與對照組樣本進(jìn)行均數(shù)比較的t檢驗.以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下可見正常K562細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞飽滿，大小不規(guī)則;而經(jīng)10 mmol/L阿司匹林處理后的K562細(xì)胞形態(tài)改變不明顯.當(dāng)阿司匹林的濃度達(dá)到20 mmol/L時細(xì)胞變小，變圓形，細(xì)胞崩解成許多碎片，細(xì)胞數(shù)目明顯減少.尤其經(jīng)過30 mmol/L阿司匹林處理的細(xì)胞懸浮脫落，可見較多死細(xì)胞(圖1A).Hoechst 33258染色結(jié)果顯示阿司匹林處理后的K562細(xì)胞核內(nèi)可見致密的藍(lán)色熒光，核固縮出現(xiàn)，并呈阿司匹林濃度依賴性(圖1B).結(jié)果表明，阿司匹林促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡.

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不同濃度阿司匹林對K562細(xì)胞的影響(A:光學(xué)顯微鏡下觀察;B:Hoechst 33258染色觀察)Fig.1 Effects of different concentrations of aspirin on the morphology of K562 cells(A:An optical microscopic observation;B:Hoechst 33258 staining observation)

2.2 阿司匹林對細(xì)胞增殖的影響

采用不同濃度的阿司匹林處理K562細(xì)胞，MTT法測定結(jié)果顯示隨著阿司匹林濃度的增大和作用時間的延長，K562細(xì)胞的存活數(shù)顯著下降.阿司匹林處理24 h后細(xì)胞大多數(shù)凋亡，48 h后細(xì)胞基本都已死亡.與對照組相比，實驗組的細(xì)胞增殖活性在24 h和48 h明顯降低，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖2A).

細(xì)胞計數(shù)法結(jié)果顯示10 mmol/L阿司匹林處理24 h后細(xì)胞數(shù)目呈減少趨勢，與0 mmol/L阿司匹林對照組相比細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);20和30 mmol/L阿司匹林處理24 h后細(xì)胞數(shù)目明顯低于對照組(P＜0.05).阿司匹林處理48 h后K562細(xì)胞數(shù)目隨著阿司匹林濃度的增大和作用時間的延長迅速下降(P＜0.01)(圖2B).軟瓊脂克隆形成實驗也發(fā)現(xiàn)隨著阿司匹林濃度的增大K562細(xì)胞的克隆形成能力急劇下降.阿司匹林各濃度與對照組相比差異都很顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2C).

圖2 細(xì)胞增殖分析阿司匹林對K562細(xì)胞的影響A:MTT法檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細(xì)胞后的抑制曲線;B:細(xì)胞計數(shù)法檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細(xì)胞后的細(xì)胞數(shù)目變化;C:軟瓊脂克隆形成實驗檢測不同濃度的阿司匹林處理K562細(xì)胞后的克隆數(shù)，內(nèi)置圖是集落細(xì)胞的放大(*P＜0.05;＊＊P＜0.01).Fig.2 Effects of aspirin on the proliferation of K562 cellsA:MTT assays of K562 cells treated with different concentrations of aspirin.B:Cell counting assay of treated K562 cells.C:Soft agar colony formation assay of K562 cells treated with aspirin.The inset shows the amplification of colony cells.*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01.

2.3 阿司匹林對細(xì)胞凋亡的影響

K562細(xì)胞用阿司匹林處理36 h后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，結(jié)果表明K562的晚期凋亡及凋亡后死亡數(shù)量隨著阿司匹林濃度的增加而增加，而相應(yīng)的存活細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的下降趨勢.尤其K562細(xì)胞在30 mmol/L的阿司匹林作用下，早期凋亡細(xì)胞所占比例為(11.71±4.84)%，晚期凋亡和死亡細(xì)胞所占比例為(58.01±5.19)%.濃度為20 mmol/L和30 mmol/L的阿司匹林組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而10 mmol/L的阿司匹林組與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)(表1).

表1 流式細(xì)胞儀檢測阿司匹林對K562細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effects of aspirin on K562 cell apoptosis detected by FACS

2.4 阿司匹林對裸鼠成瘤能力的影響

裸鼠體內(nèi)實驗觀察可見，腹腔注射阿司匹林后裸鼠的腫瘤生長明顯減慢，瘤組織上的血管較少，腫瘤的抑制率為37% ～42%(圖3A).與生理鹽水對照組相比腫瘤的質(zhì)量和體積差異顯著，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖3B-3D).這些結(jié)果提示阿司匹林對K562細(xì)胞株在裸鼠中的成瘤有明顯的抑制作用.

2.5 細(xì)胞信號通道蛋白表達(dá)的影響

提取正常對照組和阿司匹林處理實驗組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行Western印跡分析細(xì)胞信號通道蛋白的表達(dá)量變化.結(jié)果顯示，以GAPDH蛋白表達(dá)量為內(nèi)參，隨著阿司匹林濃度的增加Wnt信號通道的關(guān)鍵因子βcatenin的蛋白表達(dá)量逐漸降低，而細(xì)胞周期抑制因子p21蛋白表達(dá)明顯增高.同時信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5A(STAT5A)的蛋白水平下降;細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)的重要成員多聚ADP核糖聚合酶(PARP)表達(dá)下調(diào);核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65基因的表達(dá)降低(圖4).由此可見，阿司匹林可能影響Wnt、STAT、NF-κB信號通道和細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長和增殖.

圖3 裸鼠成瘤實驗(A:全身圖;B:腫瘤圖;C:腫瘤質(zhì)量比較;D:腫瘤體積變化)Fig.3 Effect of aspirin on the in vivo tumorigenesis of K562 cells in nude mice(A:the whole-body images;B:the tumor image;C:the tumor weight measurement;D:the tumor volume measurement)

圖4 阿司匹林對細(xì)胞信號通道蛋白的表達(dá)影響Fig.4 Effects of aspirin on the protein levels of cell signaling pathways

3 討論

阿司匹林是醫(yī)學(xué)史上的經(jīng)典藥物，也是應(yīng)用最廣泛的藥物.近來發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以降低癌癥的發(fā)病風(fēng)險和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險［5］.阿司匹林在體內(nèi)外對多種體內(nèi)致癌物誘發(fā)性和移植性腫瘤均有明顯的抑制作用，而且腹腔注射阿司匹林對小鼠等均有顯著抗腫瘤的作用［6-9］.血栓可促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，阿司匹林對抗腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散可能跟阿司匹林預(yù)防和破壞腫瘤細(xì)胞周圍的血栓從而防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)［11］.因而阿司匹林是一種很好的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑［12-13］.

白血病是起源于骨髓的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的化療毒副作用大，易復(fù)發(fā)，高耐藥性.作者的研究證實阿司匹林能夠體外促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞凋亡性死亡，具有明顯的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目變化，而且存在濃度和作用時間的依賴性.采用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)30 mmol/L濃度的阿司匹林對K562細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用最明顯，細(xì)胞毒性作用最強(qiáng).裸鼠成瘤實驗也顯示阿司匹林能有效抑制人K562裸鼠移植瘤的生長，實驗組的腫瘤體積和質(zhì)量明顯低于對照組，抑瘤率為37% ～42%.本實驗未發(fā)現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移，這可能與K562細(xì)胞在裸鼠中轉(zhuǎn)移潛能低有關(guān).阿司匹林能否抑制K562轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，需用不同的實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行進(jìn)一步的研究.總之，這些結(jié)果提示阿司匹林可能具有一定的治療慢性粒細(xì)胞白血病的效果.

近年來的研究表明阿司匹林抗癌的機(jī)制有下調(diào)抑制凋亡bcl-2基因的活性，上調(diào)促進(jìn)凋亡的bax基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］;抑制NF-κB活性導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯［15］;抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白的表達(dá)從而抑制炎癥和細(xì)胞分裂或降低前列腺素的合成而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［16］;誘導(dǎo)自殺相關(guān)因子Fas表達(dá)，下調(diào)Fas配體(FasL)表達(dá)，通過 Fas-FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷［17］.本實驗提示阿司匹林降低了 β-catenin、STAT5A、PARP和NF-κB p65在K562細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，而細(xì)胞周期抑制因子p21蛋白的表達(dá)增高.β-catenin是Wnt信號通道的關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)了癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移［18］.STAT通道持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，目前發(fā)現(xiàn)STAT5A缺失可抑制癌細(xì)胞的存活率和延緩小鼠模型上乳腺癌的進(jìn)展，提示降低STAT5A的活性可能是乳腺癌治療的有效途徑［19］.PARP主要在細(xì)胞過程如DNA修復(fù)和程序化細(xì)胞死亡中起作用，有研究表明PARP抑制劑引起DNA修復(fù)缺陷，這是腫瘤治療的一類新藥［20］.轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65與腫瘤轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡抵抗等密切相關(guān)，小干擾RNA沉默NF-κB p65基因表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1增殖并誘導(dǎo)其凋亡［21］.p21是一個抑癌基因，與細(xì)胞周期蛋白及其激酶復(fù)合物結(jié)合抑制Rb蛋白質(zhì)的磷酸化而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，從而阻止細(xì)胞周期從G1過渡到S期，抑制細(xì)胞增殖.并且p21的低表達(dá)與多數(shù)腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)［22］.這些提示阿司匹林影響慢性粒細(xì)胞白血病中的Wnt、STAT、NF-κB信號通道和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，其具體作用機(jī)制及其細(xì)胞信號途徑有待更深入的研究.由此可見，阿司匹林對慢性粒細(xì)胞白血病的治療具有重要的應(yīng)用和開發(fā)前景.

［1］DEININGER M W，GOLDMAN J M，MELO J V.The molecular biology of chronic myeloid leukemia［J］.Blood，2000，96(10):3343-3356.

［2］CLIFT R A，BUCKNER C D，THOMAS E D，et al.Marrow transplantation for patients in accelerated phase of chronic myeloid leukemia［J］.Blood，1994，84(12):4368-4373.

［3］HOLTZ M S，SLOVAK M L，ZHANG F，et al.Imatinib mesylate(STI571)inhibits growth of primitive malignant progenitors in chronic myelogenous leukemia through reversal of abnormally increased proliferation［J］.Blood，2002，99(10):3792-3800.

［4］GRAHAM S M，JORGENSEN H G，ALLAN E，et al.Primitive，quiescent，Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro［J］.Blood，2002，99(1):319-325.

［5］ROTHWELL P M，PRICE J F，F(xiàn)OWKES F G，et al.Short-term effects of daily aspirin on cancer incidence，mortality，and non-vascular death:analysis of the time course of risks and benefits in 51 randomised controlled trials［J］.Lancet，2012，379(9826):1602-1612.

［6］BARON J A.Aspirin and NSAIDs for the prevention of colorectal cancer［J］.Recent Results Cancer Res，2009，181:223-229.

［7］BONIFAZI M，GALLUS S，BOSETTI C，et al.Aspirin use and pancreatic cancer risk［J］.Eur J Cancer Prev，2010，19(5):352-354.

［8］VAN DyKE A L，COTE M L，PRYSAK G，et al.Regular adult aspirin use decreases the risk of non-small cell lung cancer among women［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(1):148-157.

［9］HOLMES M D，CHEN W Y，LI L，et al.Aspirin intake and survival after breast cancer［J］.J Clin Oncol，2010，28(9):1467-1472.

［10］CHATTOPADHYAY M，KODELA R，OLSON K R，et al.NOSH-aspirin(NBS-1120)，a novel nitric oxide-and hydrogen sulfide-releasing hybrid is a potent inhibitor of colon cancer cell growth in vitro and in a xenograft mouse model［J］.Biochem Biophys Res Comm，2012，419(3):523-528.

［11］KORT W J，HULSMAN L O，VAN SCHALKWIJK W P，et al.Reductive effect of aspirin treatment on primary tumor growth and metastasis of implanted fibrosarcoma in rats［J］.J Natl Cancer Inst，1986，76(4):711-720.

［12］ROTHWELL P M，WILSON M，ELWIN C E，et al.Long-term effect of aspirin on colorectal cancer incidence and mortality:20-year follow-up of five randomised trials［J］.Lancet，2010，376(9754):1741-1750.

［13］THWELL P M，F(xiàn)OWKES F G，BELCH J F，et al.Effect of daily aspirin on long-term risk of death due to cancer:analysis of individual patient data from randomised trials［J］.Lancet，2011，377(9759):31-41.

［14］KIM K Y，SEOL J Y，JEON G A，et al.The combined treatment of aspirin and radiation induces apoptosis by the regulation of bcl-2 and caspase-3 in human cervical cancer cell［J］.Cancer Lett，2003，189(2):157-166.

［15］GRADILONE A，SILVESTRI I，SCARPA S，et al.Failure of apoptosis and activation on NFkappaB by celecoxib and aspirin in lung cancer cell lines［J］.Oncol Rep，2007，17(4):823-828.

［16］SOLHEIM S，PETTERSEN A A，ARNESEN H，et al.No difference in the effects of clopidogrel and aspirin on inflammatory markers in patients with coronary heart disease［J］.Thromb Haemost，2006，96(5):660-664.

［17］陸維祺，艾志龍，沈兆忠.阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及Fas/FasL表達(dá)的影響［J］.中國癌癥雜志，2003，13(4):350-352.

［18］TIEN L T，ITO M，NAKAO M，et al.Expression of beta-catenin in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2005，11(16):2398-2401.

［19］REN S，CAI H R，LI M，et al.Loss of Stat5a delays mammary cancer progression in a mouse model［J］.Oncogene，2002，21(27):4335-4339.

［20］VINAYAK S，F(xiàn)ORD J M.PARP inhibitors for the treatment and prevention of breast cancer［J］.Curr Breast Cancer Rep，2010，2(4):190-197.

［21］王殿忠，謝 敏，潘一明，等.小干擾RNA沉默NF-κB P65基因表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1增殖與凋亡的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，28(2):184-189.

［22］ABBAS T，DUTTA A.p21 in cancer:intricate networks and multiple activities［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(6):400-414.