朱廷準，徐英輝，李曉明，羅力涵，梁國標*

腦膠質瘤是人類神經系統(tǒng)腫瘤中最常見的類型，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點［1］。目前國內外尚無理想的治療方法，常用的化療藥物療效較差。欖香烯(Elemene)是從中藥莪術中提取的非細胞毒性藥物，目前已應用于肺癌、膀胱癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療［2-3］。前期的多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯可以顯著抑制患者體內膠質瘤的生長，延長生存期，且未出現(xiàn)明顯的毒副作用［4-5］。但是由于其抗膠質瘤的分子機制不明，限制了在臨床上的應用。本實驗通過觀察欖香烯對人U87MG膠質瘤細胞的增殖抑制及細胞周期阻滯作用，結合MEK信號通路中的MKK3和MKK6分子在其中的關鍵性作用，初步闡述了欖香烯抗膠質瘤作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人U87MG和U251膠質瘤細胞系均購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。欖香烯由大連金港制藥有限公司生產。標準胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國 GIBCO公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。MTT試劑、碘化丙啶(PI)購自德國 Sigma公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。磷酸化蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。DN-MKK3質粒、DN-MKK6質粒由加拿大多倫多大學 Jim Woodgett教授惠贈?？筂KK3抗體購自美國Santa公司，抗p-MKK3、MKK6和p-MKK6抗體購自英國Abcam公司。辣根酶標記的羊抗兔及兔抗小鼠抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人U87MG和U251膠質瘤細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素 50 IU/mL，鏈霉素 50 mg/mL)中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 細胞增殖檢測(MTT法) 將對數(shù)生長期的U87MG和U251膠質瘤細胞以6×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中(每組設5個復孔)，培養(yǎng)24 h，分別加入 0、20、40、60、80 μg/mL 濃度的欖香烯，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育0、12、24、36、48 h。然后每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內培養(yǎng)液，用PBS沖2遍后，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，繪制標準曲線。

1.2.3 Western blot檢測 ①按實驗需要處理細胞后，胰酶消化并收獲細胞，置于冰盒上操作。將細胞放置于Eppendorf管中。于4℃ 3 000 rpm離心5 min以沉淀細胞，棄上清。用4℃冷PBS洗滌細胞沉淀1次。用凱基公司的磷酸化蛋白提取試劑盒，按說明書比例配制細胞裂解液。每EP管中加入200 μL裂解液重懸細胞沉淀物，吹打。在5×SDS上樣緩沖液中煮細胞5 min，使蛋白充分變性，應用BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基)對樣品蛋白進行定量檢測。②按濃縮膠6%、分離膠10%的濃度，配制聚丙烯酰胺凝膠。加樣，在150 V電壓下電泳約2.5～3 h，直至溴酚藍指示劑到達距玻璃板下緣約1 cm時停止電泳。將電泳后的SDS-PAGE凝膠轉到NC膜上。5%脫脂奶粉(TTBS配制)4℃過夜封閉。一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h。ECL檢測，Gel-Pro Analyzer 4.0軟件(Media Cybernetics)分析目的條帶。

1.2.4 基因轉染 將U87MG膠質瘤細胞以4×105/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用Lipofectamine 2000脂質體通過瞬時轉染方法(步驟詳見Lipofectamine 2000說明書)，將空質粒以及HA標簽標記的DN-MKK3和DNMKK6質粒轉染進入U87MG細胞中。

1.2.5 細胞周期檢測 取轉染后處于對數(shù)生長期的人U87MG膠質瘤細胞，以4×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，欖香烯共同孵育24 h，收集各組細胞，離心，棄上清，PBS洗2次，加入70%乙醇1 mL，充分混勻，-20℃過夜。檢測前離心，棄上清，PBS洗2次，加0.2 mg/mL Rnase 37℃共同孵育1 h，PI染液置暗處染色30 min，細網過濾，于流式細胞儀上進行熒光檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件。每一項分析至少有3次結果。數(shù)值以表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 欖香烯抑制人U87MG和U251膠質瘤細胞增殖 分別以 0(對照組)、20、40、60、80 μg/mL(藥物組)濃度的欖香烯處理對數(shù)生長期的人U87MG和U251膠質瘤細胞，然后行MTT法檢測細胞活性，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結果顯示，欖香烯能顯著抑制人U87MG和U251膠質瘤細胞的增殖活性，該抑制作用呈時間和劑量依賴性(圖1A、B)。欖香烯處理后的U87MG細胞突起收縮、形態(tài)變圓、胞核縮小，部分細胞松動脫落，并在一定程度上出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象(圖1C～E)。

圖1 欖香烯抑制人U87MG和U251膠質瘤細胞增殖與時間和劑量的關系

2.2 欖香烯增加人U87MG膠質瘤細胞中MKK3和MKK6的磷酸化水平 不同濃度的欖香烯處理U87MG細胞1 h后行Western blot檢測。結果顯示，隨著欖香烯濃度的增加，p-MKK3和p-MKK6的表達水平顯著增高，而MKK3和MKK6的總蛋白的表達未出現(xiàn)明顯變化(見圖2)。

圖2 欖香烯增加人U87MG膠質瘤細胞中MKK3和MKK6的磷酸化水平

2.3 抑制MKK3和MKK6的活性導致欖香烯的抗膠質瘤作用降低 為進一步檢測MKK3/6在欖香烯抗膠質瘤細胞增殖中的作用，將DN-MKK3和DN-MKK6突變質粒轉染進入U87MG細胞中。設空質粒載體組為對照組(圖3，柱a)，其他4組為實驗組(圖3，柱b～e)。采用MTT法檢測細胞的增殖活性。結果顯示，在60 μg/mL欖香烯的作用下，DN-MKK3 組(圖3，柱 c)、DN-MKK6 組(圖3，柱d)以及 DN-MKK3+DN-MKK6共轉染組(圖3，柱e)的細胞活性明顯高于空質粒轉染組(圖3，柱 b，P＜0.05或 P＜0.01)。結果顯示，阻斷MKK3/6活性可使欖香烯的抗瘤作用顯著減弱，MKK3/6介導欖香烯的抗膠質瘤細胞增殖作用。

圖3 抑制MKK3和MKK6活性與欖香烯抗膠質瘤增殖作用的關系

在空質粒、DN-MKK3、DN-MKK6和 DNMKK3+DN-MKK6質粒轉染進入U87MG細胞后，細胞被60 μg/mL的欖香烯處理24 h，行MTT檢測。與空質粒組相比，DN-MKK3組(柱 c)和DN-MKK6組(柱d)中欖香烯抗細胞增殖作用部分被削弱。而在DN-MKK3+DN-MKK6共轉染組(柱e)中，欖香烯的抗瘤作用幾乎被完全抵消。

2.4 抑制MKK3和MKK6的活性導致欖香烯的細胞周期G0/G1期阻滯作用減弱 本實驗包括5組:欖香烯+空質粒組、欖香烯+DN-MKK6組、欖香烯+DN-MKK3組、欖香烯+DN-MKK6+DNMKK3組以及空質粒組(圖4 E)。流式細胞術檢測結果顯示，欖香烯+空質粒組中G0/G1期比例較空質粒組明顯升高。在欖香烯的作用下，DNMKK3(圖4 C)、DN-MKK6(圖4 B)和DN-MKK3+DN-MKK6共轉染組(圖4d)G0/G1期的比例較空質粒組(圖4 A)更低(P＜0.05或P＜0.01)，即:抑制MKK3和MKK6的活性可導致U87MG細胞對欖香烯的抗藥性增加。結果表明，欖香烯的抗腫瘤作用是通過激活MKK3/6通路，將膠質瘤細胞阻滯于G0/G1期，進而抑制膠質瘤細胞的增殖來實現(xiàn)的。

3 討論

膠質瘤是一種最常見、最頑固的顱內惡性腫瘤。目前，臨床治療膠質瘤主要以手術、化療或放療為主要治療手段，但效果均不理想。因此，如何提高膠質瘤療效，延長患者的生存期，已成為神經外科最富挑戰(zhàn)性而又亟待解決的一個難題。

欖香烯是從姜科植物溫郁金(莪術)中提取的以欖香烯為主要成分的混合物。實驗藥理學研究證實，欖香烯對體內外多種腫瘤細胞具有較強的抑制和殺傷效應，而且該作用具有一定的特異性。欖香烯不但具有直接抗腫瘤作用，還有免疫保護與放化療協(xié)同作用，能緩解癌性疼痛、升高白細胞和抑制血小板聚集等。相對于大多數(shù)化療藥物而言，該藥毒副作用小，無明顯肝、腎功能損害，不發(fā)生骨髓抑制［6］。筆者在前期的臨床應用中發(fā)現(xiàn)，欖香烯對膠質瘤具有明顯的抗腫瘤作用。然而，由于欖香烯抗膠質瘤作用的分子機制不明，成為其在臨床推廣應用的“瓶頸”。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases，MAPKs)是哺乳動物細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡以及細胞間的功能同步等多種過程［7-8］。MAPKs經其上游的MAPK激酶激酶(MKKK)和MAPK激酶(MEK)磷酸化而活化，形成“刺激-MKKK-MEK-MAPK-反應底物”的瀑布式級聯(lián)反應。MAPKs信號通路主要包括p38 MAPK、JNK和ERK 3條通路［9-11］。MEK中的兩個重要成員MKK3和MKK6是p38 MAPK的上游激酶。國內外的多項研究顯示，MKK3/6-p38 MAPK通路在腫瘤細胞的增殖和凋亡中起著重要作用。在NIH3T3細胞中，亞砷酸鈉通過激活p38 MAPK引起短暫的細胞生長延遲［12］;MKK3/6-p38 MAPK在笑氣和細胞因子誘導的胰腺細胞凋亡中扮演重要角色［13］。此外，MKK3/6也介導了異黃酮衍生物、丁酸鈉、TNF-α、2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷等多種藥物的抗癌作用［14-15］。傳統(tǒng)的觀點認為，MKK3/6是p38 MAPK的特異性激活因子，但最近的研究顯示，p38 MAPK可不依賴于“MKKKMKK3/6-p38 MAPK”途徑而被激活。本課題組前期的研究顯示，p38 MAPK的激活和Raf/ERK的抑制介導了欖香烯的抗膠質瘤作用［16-19］。因此，MKK3/6是研究欖香烯抗膠質瘤機制過程中的關鍵環(huán)節(jié)。

圖4 MKK3和MKK6的活性抑制與欖香烯細胞周期G0/G1期阻滯作用關系

本實驗顯示，欖香烯可以使U87MG細胞停滯于G0/G1期，阻止其向DNA復制加倍的S期及M期轉化，從而造成腫瘤細胞的生長緩慢和增殖活性降低。進一步的研究顯示，MKK3/6信號通路的磷酸化激活在其中發(fā)揮至關重要的作用。相反，通過轉染顯性負突變體質粒抑制MKK3和MKK6的活性則可以抵消欖香烯的抗膠質瘤作用。因此，MKK3/6激活對欖香烯抗膠質瘤增殖的介導作用為欖香烯的臨床應用在分子水平上提供了理論依據(jù)，也為膠質瘤的分子治療提供了重要的參考靶點。然而，欖香烯是如何調控MKK3/6信號通路的活性，其上下游還有哪些分子事件發(fā)生，尚有待于更深入的研究。

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