劉旭 郭曉鐘 李宏宇 陳江 許文達(dá)

·論著·

KAI1基因轉(zhuǎn)染對乏氧培養(yǎng)下胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞增殖、遷移及VEGF表達(dá)的影響

劉旭 郭曉鐘 李宏宇 陳江 許文達(dá)

目的觀察轉(zhuǎn)染KAI1基因的人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)后細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的變化，探討其可能機(jī)制。方法應(yīng)用KAl1基因過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乏氧條件培養(yǎng)后的人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞KAI1、VEGF-C、VEGF-A蛋白的表達(dá)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖，細(xì)胞劃痕及Transwell小室實驗觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移及侵襲能力，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測培養(yǎng)上清液中人VEGF-C、VEGF-A含量。結(jié)果轉(zhuǎn)染KAI1基因后的MiaPaCa-2-K細(xì)胞的KAI1蛋白表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著增加[(0.549±0.021)比0]。乏氧條件培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖無明顯變化，但它的遷移距離明顯縮短，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少[(14.0±5.8)比(43.0±14.4)個，P<0.05]；細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)顯著降低[(0.218±0.043)比(0.745±0.069)。P<0.05]，但VEGF-A表達(dá)變化不顯著；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量顯著減少[(1236±247)比(2045±221)pg/ml，P<0.01]。結(jié)論轉(zhuǎn)染KAl1基因的MiaPaCa-2細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)后的細(xì)胞遷移、侵襲能力減弱，其機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF-C的表達(dá)來抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的。

胰腺腫瘤； 缺氧； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞運動； 血管內(nèi)皮生長因子類； KAI1基因

【Keywrods】 Pancreatic neoplasms； Anoxia； Cell proliferation; Cell movement; Vascular endothelial growth factors; KAI1 gene

早期即發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移是胰腺癌重要特征和預(yù)后極差的重要因素[1]。早期胰腺癌組織常處于乏氧狀態(tài)，乏氧狀態(tài)下胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移明顯活躍[2]，因此，乏氧狀態(tài)可能促進(jìn)了胰腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移。KAI1基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其對胰腺癌的遷移、侵襲、自噬均具有調(diào)節(jié)作用。近期研究結(jié)果顯示，在乏氧狀態(tài)下KAI1是一種重要的乏氧靶基因[3]。本研究將插入KAI1基因的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞，觀察乏氧條件培養(yǎng)后細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及VEGF蛋白表達(dá)的變化，探討KAI1基因調(diào)控胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的可能作用及機(jī)制。

材料和方法

一、KAl1基因轉(zhuǎn)染

MiaPaCa-2細(xì)胞株為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科保存。攜帶人KAI1全長cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-KAI1) 由本研究組前期構(gòu)建[4-5]。在完全密閉的方盒中持續(xù)通入由乏氧設(shè)備產(chǎn)生的乏氧氣體(1% O2、5% CO2和94% N2)，將處于對數(shù)生長期的MiaPaCa-2細(xì)胞在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)1周后接種到6孔板。采用Lipofectamine 2000(美國Invotrogen公司)將pCMV-KAI1轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后擴(kuò)增培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)染pCMV空質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

二、蛋白質(zhì)印跡法

收集各組對數(shù)生長期的2×106個細(xì)胞，裂解并收集細(xì)胞總蛋白，采用BCATM蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測KAI1蛋白及VEGF-C、VEGF-A蛋白的表達(dá)。各種抗體均購自美國Santa Cruz公司，以β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件(BioRad)測定蛋白條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

三、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法

將各組對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整密度至1×104個/ml，取200 μl細(xì)胞懸液接種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每組每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)到時間點時，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl DMSO振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上檢測各孔490 nm波長處的吸光值(A490值)，以只含培養(yǎng)液并加入150 μl DMSO的空白對照孔調(diào)零，繪制細(xì)胞生長曲線。

四、Transwell小室侵襲實驗

將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用無血清DMEM調(diào)整到密度為1×105個/ml。在Transwell小室(美國Costar公司)的上室加入細(xì)胞懸液100 μl，下室加入600 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)3個小室。在乏氧條件下培養(yǎng)12 h。取出小室，用PBS淋洗，用棉簽輕輕刮除上室中未遷移的細(xì)胞，固定、染色、計算穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照。實驗重復(fù)3次。

五、細(xì)胞劃痕實驗

收獲對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。乏氧條件下培養(yǎng)至細(xì)胞呈單層，以移液器槍頭在培養(yǎng)孔底部呈“1”型劃過。以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌以棄去漂浮細(xì)胞，更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48、72 h后鏡下觀察細(xì)胞爬過劃痕的情況并拍照。實驗重復(fù)3次。

六、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞接種于12孔板中。乏氧條件培養(yǎng)下細(xì)胞貼壁生長24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心取上清液。在VEGF-C酶聯(lián)免疫試劑盒(美國Ray Bio公司)提供的已標(biāo)記的ELISA酶標(biāo)板的各孔先加入樣品稀釋液40 μl，然后再將待測樣品10 μl加于酶標(biāo)板底部(最終稀釋度為5倍)。按試劑盒說明書操作。以空白孔調(diào)零，測定各孔450 nm波長的吸光值(A450值)。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

未轉(zhuǎn)染的MiaPaCa-2細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(MiaPaCa-2-p)均無KAI1蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染pCMV-KAI1的MiaPaCa-2細(xì)胞(MiaPaCa-2-K)的KAI1蛋白表達(dá)量為0.549±0.021(圖1)，提示成功構(gòu)建了KAI1基因高表達(dá)的MiaPaCa-2細(xì)胞株。

圖1 各組MiaPaCa-2細(xì)胞的KAI1蛋白表達(dá)

二、乏氧條件培養(yǎng)下各組細(xì)胞的增殖狀況

在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)24、48、72、96 h后，MiaPaCa-2細(xì)胞的A490值分別為0.18、0.20、0.39、0.44；MiaPaCa-2-p細(xì)胞為0.17、0.19、0.36、0.46，MiaPaCa-2-K細(xì)胞為0.16、0.17、0.33、0.41。3組細(xì)胞的增殖速度無明顯差異(圖2)。

圖2 各組MiaPaCa-2細(xì)胞的生長曲線

三、乏氧條件培養(yǎng)下各組細(xì)胞的遷移能力

MiaPaCa-2-K 組細(xì)胞的遷移距離較MiaPaCa-2及MiaPaCa-2-p細(xì)胞均短(圖3)。

四、乏氧條件培養(yǎng)下各組細(xì)胞的侵襲能力

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(43.0±14.4)、(48.0±12.6)、(14.0±5.8)個(圖4)，MiaPaCa-2-K組的穿膜細(xì)胞數(shù)較MiaPaCa-2-p組及MiaPaCa-2組均顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為10.67、12.85，P值均<0.05)。

圖3 各組MiaPaCa-2細(xì)胞的遷移情況(×100)

圖4 各組MiaPaCa-2細(xì)胞的穿膜細(xì)胞(×200)

五、乏氧條件培養(yǎng)下各組細(xì)胞VEGF-C、VEGF-A蛋白表達(dá)

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K細(xì)胞VEGF-C表達(dá)量分別為0.745±0.069、0.687±0.087、0.218±0.043，VEGF-A表達(dá)量分別為0.389±0.073、0.385±0.067、0.365±0.058(圖5)。MiaPaCa-2-K組細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)較其他兩組細(xì)胞顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為13.12、11.65，P值均<0.05)，但各組間VEGF-A的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 各組MiaPaCa-2細(xì)胞的VEGF-A、VEGF-C蛋白表達(dá)

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量分別為(2045±221)、(2163±239)、(1236±247)pg/ml，MiaPaCa-2-K組細(xì)胞顯著低于其他兩組(t值分別為11.36、10.93，P值均<0.01)。

討 論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特點，淋巴轉(zhuǎn)移是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。由于毛細(xì)淋巴管的管腔大而不規(guī)則(直徑10～60 μm)，管壁僅由一層淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和極薄的結(jié)締組織構(gòu)成，且其主要功能是可根據(jù)組織內(nèi)壓調(diào)節(jié)細(xì)胞間的連接以容許液體及大分子物質(zhì)通過[6]，因此，毛細(xì)淋巴管具有比毛細(xì)血管更大的通透性，癌細(xì)胞也更容易進(jìn)入毛細(xì)淋巴管發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。

KAI1基因編碼的蛋白質(zhì)CD82屬Ⅲ型膜蛋白的4次跨膜超家族(transmembrane 4 su perfamily，TM4SF)[6]，具有4個高度保守的疏水跨膜結(jié)構(gòu)(TM1-4)、一個近N端小的細(xì)胞外環(huán)(extracellular loops1，EC1)和一個近C端大的細(xì)胞外親水環(huán)狀結(jié)構(gòu)(EC2)。該結(jié)構(gòu)平行于細(xì)胞膜，也決定了該蛋白功能的特異性。它可介導(dǎo)包括細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)等在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細(xì)胞的聚集、粘附、遷移、增殖過程中具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究組以往的研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌(Ⅰ、Ⅱ期) KAI1 mRNA表達(dá)顯著高于伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期胰腺癌(Ⅲ、Ⅳ期)，KAI1基因高表達(dá)顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力[7]。細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇(S1P)的產(chǎn)生是由鞘氨醇激酶(SPK)催化生成的，而SPK信號通路與細(xì)胞遷移密切相關(guān)。高表達(dá)KAI1基因的胰腺癌細(xì)胞S1P的合成降低，因此推測KAI1基因具有抑制胰腺癌細(xì)胞SPK活性的作用，并抑制胰腺癌細(xì)胞遷移[5]。本研究在乏氧條件下培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2，結(jié)果顯示 KAI1基因的高表達(dá)對細(xì)胞增殖作用不明顯，但可顯著抑制癌細(xì)胞的遷移，可能是其抑制淋巴轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。

相關(guān)研究顯示，部分VEGF家族成員和受體信號通路在淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性作用。并已證實胰腺癌細(xì)胞可以合成并釋放VEGF-C、VEGF-A等因子[8-9]，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，趨化其向病變部位遷移[10]，最終促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在乏氧條件培養(yǎng)下KAI1高表達(dá)對胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞VEGF-A的表達(dá)無明顯作用，但顯著抑制了VEGF-C的表達(dá)及其在培養(yǎng)上清中的含量，提示KAI1基因抑制淋巴轉(zhuǎn)移的作用可能是通過下調(diào)VEGF-C表達(dá)來實現(xiàn)的。

[1] Pawlik TM, Gleisner AL, Cameron JL, et al. Prognostic relevance of lymph node ratio following pancreatic oduodenectomy for pancreatic cancer. Surgery, 2007, 141:610- 618.

[2] Hill RP，Marie-Eqyptienne DT，Hedley DW．Cancer stem cells，hypoxia and metastasis．Semin Radiat Oncol，2009，19：106-111．

[3] Kim B, Boo K, Lee JS, et al. Identification of the KAI1 metastasis suppressor gene as a hypoxia target gene. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 393:179-184.

[4] 郭曉鐘, 徐建華，劉民培，等.KAI1基因抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討.中華內(nèi)科雜志,2004,43:360-362.

[5] 郭曉鐘,張巍巍,王立生,等.KAI1基因抑制胰腺癌細(xì)胞鞘氨醇激酶活性及其遷移.中華內(nèi)科雜志, 2006,45:752-754.

[6] Butler MG, Isogai S, Weinstein BM. Lymphatic development. Birth Defects Res C Embryo Today, 2009, 87:222-231.

[7] Miranti CK. Controlling cell surface dynamics and signaling: How CD82/KAI1 suppresses metastasis. Cell Signal, 2009,21:196-211．

[8] Su JL, Yang PC, Shih JY, et al. The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells. Cancer Cell, 2006, 9:209-223.

[9] Hirakawa S, Brown LF, Kodama S, et al. VEGF-C-induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites. Blood, 2007,109:1010-1017.

[10] Saintigny P, Kambouchner M, Ly M, et al. Vascular endothelial growth factor-C and its receptor VEGFR-3 in non-small-cell lung cancer: concurrent expression in cancer cells from primary tumour and metastatic lymph node. Lung Cancer, 2007,58:205-213.

EffectsofKAl1genetransfectiononproliferation,migration,invasionandVEGFexpressionofpancreaticcancerMiaPaCa-2cellsunderhypoxiccondition

LIUXu,GUOXiao-zhong,LIHong-yu,CHENJiang,XUWen-da.

DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,Shenyang110016,China

GUOXiao-zhong,Email：guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of KAll gene transfection on proliferation, migration, invasion and VEGF expression of pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells under hypoxic condition, and explore possible mechanism.MethodsThe pcMV-KAI1 vector which contained the full length of KAI1 cDNA was transfected into pancreatic cancer cells MiaPaCa-2, and KAI1, VEGF C, VEGF A protein expressions were determined by Western blot. The proliferation of pancreatic cancer cells was evaluated by MTT method. Wound-healing assay and cell invasion assay were used to detect the migration and invasion of pancreatic cancer cells. The expression of VEGF C, VEGF A in supernatant of culture was measured by ELISA method.ResultsThe expression of KAI1 protein in MiaPaCa-2 K transfected with KAI1 was significantly higher than that in non-transfected cells [(0.549±0.021)vs0,P<0.05]. The proliferation under hypoxic condition was not significantly different, but the migration distance was significantly shorter and the number of transmembrane cell was significantly decreased [(14.0±5.8)vs(43.0±14.4),P<0.05]. The expression of VEGF-C in cell was significantly decreased [(0.218±0.043)vs(0.745±0.069),P<0.05], but the expression of VEGF-A was not significantly different; the expression of VEGF-C in cell culture supernatants was significantly decreased [(1236±247)vs(2045±221)pg/ml,P<0.01].ConclusionsThe migration, invasion ability of pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells with KAll transfection under hypoxic condition is decreased, and the possible mechanism of inhibiting lymphatic metastasis is down-regulation of VEGF-C expression.

2013-06-24)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.003

國家自然科學(xué)基金(81071982)

110016 遼寧沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com