江蘇省泰州市食品藥品檢驗所（225300）黃勇 柏大為

根據2010年版《中國藥典（二部）》的規(guī)定[1]，建立藥品無菌檢查方法時。應進行方法學驗證，以證明方法的適用性。注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、傷寒沙門菌、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬等腸桿菌科細菌和銅綠假單孢菌有良好抗菌作用。頭孢哌酮主要抑制細菌細胞壁的合成。舒巴坦本身抑菌作用較弱，是一種競爭性、不可逆的β內酰胺酶抑制藥，與頭孢哌酮聯合應用后，可增加頭孢哌酮抵抗多種β內酰胺酶降解的能力，對頭孢哌酮產生明顯的增效作用[2][3][4]。為確保方法科學、結果準確，本文建立了注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉無菌檢查方法，并驗證檢查法的可靠性，現總結如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HTY-2000A集菌儀、脫卸式薄膜過濾器，均由杭州高德醫(yī)療器械有限公司生產。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；PL202-L電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 菌種 驗證用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]第4代；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]第3代；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]第4代；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]第4代；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]第3代；銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（F）10104]第3代。

1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基為硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均為符合藥典規(guī)定的干燥培養(yǎng)基，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 稀釋劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液均按藥典方法配制。

1.5 樣品 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（齊魯制藥有限公司，批號為1070229BR，規(guī)格1.0g/瓶）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1ml，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)物1ml，加0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)5～7d，用0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗脫并過濾孢子懸液至無菌試管內，再取孢子懸液1ml加0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液5ml，作為原液，備用。取原液1ml，加0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍遞增稀釋制成含50～100cfu的孢子懸液。

2.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3d；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種細菌作為空白對照，培養(yǎng)5d，每日觀察結果。結果如下：空白對照管無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管細菌均生長良好，結果靈敏度檢查符合規(guī)定。見附表1。

2.3 方法驗證

2.3.1 方法的選擇 注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉為注射用凍干粉針，抗生素有較強的抑菌作用，所以采用薄膜過濾法進行試驗。

2.3.2 方法驗證試驗1 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，作為供試品溶液，采用封閉式薄膜過濾器過濾，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為供試品陰性對照組，另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量實驗菌，作為供試品陽性菌試驗組，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。陰性對照組：用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗100ml，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml。結果見附表2和3。

附表1 培養(yǎng)及靈敏度檢查結果

附表2 試品陽性菌試驗組實驗結果觀察表

附表3 供試品陰性與陰性對照組實驗結果觀察

2.3.3 方法驗證試驗2 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，作為供試品溶液，采用封閉式薄膜過濾器過濾，用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入青霉素酶（1ml/筒）并放置5min后濾干，沖洗完畢后，向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml，作為供試品陰性對照組，另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量實驗菌，作為供試品陽性菌試驗組，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d。陰性對照組：用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100ml，沖洗完畢后向過濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100ml。結果見附表2和3。

2.3.4 培養(yǎng)條件及結果觀察 由附表2和3可見，在驗證試驗1的條件下，對細菌，特別是銅綠假單孢菌和大腸埃希菌有明顯抑制作用，而實驗條件2中含供試品各管的實驗菌試驗組在300ml/膜沖洗并加入加入青霉素酶（1ml/筒）時各濾筒微生物均生長良好，陰性對照及樣品澄清無菌生長，試驗組有菌生長。說明在該檢驗條件下已去除注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的抑菌作用。

2.4 樣品的無菌檢查 取注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉30支，以無菌操作加0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后，轉移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用封閉式薄膜過濾器過濾，用1000ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗（400ml/筒），每次100ml，在最后一次沖洗液中加入青霉素酶（1ml/筒）并放置5min后濾干，于兩筒中接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（其中一筒加入小于100cfu的金黃色葡萄球菌作為陽性對照管），另一筒加入改良馬丁培養(yǎng)基，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14d，逐日觀察生長情況。

本實驗結果顯示，供試品無菌檢查陽性對照菌筒均在24h內正常生長，陰性對照均澄清呈無菌生長，無菌試驗結果符合規(guī)定，證明所建立的無菌檢查法科學、可靠，該實驗條件能消除頭孢匹胺鈉對細菌的抑制作用。

3 討論

3.1 通過方法驗證試驗表明注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉在未沖洗時對細菌有明顯的抑制作用，在沖洗量達到1000ml并加入青霉素酶之后抑菌作用消除，可以達到驗證試驗要求。

3.2 薄膜過濾法操作過程中應注意：在每次加沖洗液前應盡量抽干，每次加沖洗液后要充分振搖，每次沖洗量控制在50ml，其沖洗總量會顯著降低。