陳樞青

(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

人類對基因的認(rèn)識大致可以分為三個階段。第一階段為生物學(xué)基礎(chǔ)研究階段，其關(guān)注的重點(diǎn)在于不同物種的基因結(jié)構(gòu)，同類基因的同源性和功能差異，以及從基因水平梳理物種進(jìn)化路線和遷移路線。第二階段為遺傳背景研究階段，關(guān)注的重點(diǎn)在于人類不同個體之間在基因水平上的微小差異所造成的個體在遺傳表型上的差異，如膚色、身高、性格、特長、疾病易感性、藥物作用個體差異等，確立了基因多態(tài)性等重要概念，建立了一批遺傳病的診斷方法，探索了一些遺傳易感性疾病的風(fēng)險預(yù)測理念。第三階段為臨床個體化醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化階段，關(guān)注的重點(diǎn)深入到體細(xì)胞突變是疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，是診斷治療疾病的鑰匙。從而產(chǎn)生了許多新的概念和觀點(diǎn)，如肇事突變和無關(guān)突變、突變發(fā)生的熱點(diǎn)部位和造成疾病的重點(diǎn)部位、基因治療的靶突變、突變蛋白質(zhì)才是腫瘤特異性蛋白質(zhì)、腫瘤的免疫治療和基因治療等?，F(xiàn)就初露端倪的第三階段的進(jìn)展作一介紹。

1 基因多態(tài)性決定了個體的疾病易感性，而體細(xì)胞突變直接導(dǎo)致了疾病的發(fā)生發(fā)展

隨著人類基因組計劃的完成，人類進(jìn)入了后基因組時代，徹底闡述基因組編碼蛋白的功能，搞清DNA序列中所包含的信息是擺在人類面前的一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的使命。大量的研究表明，基因與癌癥、早老性癡呆、糖尿病、高血壓等疾病有關(guān)。事實(shí)上，近20年來人們更多地在分子水平上研究DNA突變(RFLP、SSLP、SNP等)與疾病之間的聯(lián)系，試圖證明疾病是由于遺傳決定的，卻在某種程度上忽視了環(huán)境因素對人體生理活動的影響。盡管遺傳是疾病發(fā)生的重要因素，但是對于某種特定疾病，發(fā)揮直接作用的卻是后天的體細(xì)胞突變，不同個體所具有的體細(xì)胞突變必然不同。這些突變之間相互作用，并與環(huán)境和生活方式相互影響，加大了研究基因和疾病之間關(guān)系的難度。由于全基因組測序的高成本和海量基因信息極難處理，限制了人們在基因組水平上將疾病進(jìn)行細(xì)致分類的研究。因此，目前所謂的個性化治療大多只是根據(jù)“人”的個性化，很少涉及“病”的個性化。直到最近幾年，由于全基因組測序成本大幅度降低，這個領(lǐng)域的前景才初露端倪。

體細(xì)胞突變發(fā)生的機(jī)制基本是兩種情況:其一，細(xì)胞在正常分裂時半保留復(fù)制過程中自發(fā)的少量配對錯誤，而細(xì)胞的自身修復(fù)機(jī)制未能發(fā)現(xiàn)并予以及時糾正，因此被保留進(jìn)入子代細(xì)胞;其二，環(huán)境物質(zhì)對DNA攻擊發(fā)生堿基改變而生成體細(xì)胞突變，隨著進(jìn)一步的細(xì)胞分裂進(jìn)入子代細(xì)胞。人類從父母得到的遺傳物質(zhì)也存在突變，但這些突變多數(shù)被稱為基因多態(tài)性，它是人類長期進(jìn)化過程中隨著生殖細(xì)胞突變而分布在廣大人群中的突變，因此在人群中存在一定的突變比例。目前學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為只有在人群中大于1%發(fā)生率的突變可被稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。SNP決定了個體的體質(zhì)，也就是在人與環(huán)境接觸過程中個體保護(hù)自身DNA不發(fā)生體細(xì)胞突變的能力，常稱為疾病易感性。而體細(xì)胞突變決定了疾病在實(shí)際發(fā)生發(fā)展過程中的實(shí)質(zhì)。

人體由60兆左右的細(xì)胞組成，每個細(xì)胞在其生命進(jìn)程中都會進(jìn)行多次的復(fù)制，盡管復(fù)制過程中，機(jī)體存在多種機(jī)制保證復(fù)制的高保真性，但是還是有部分DNA會發(fā)生突變，而這一突變產(chǎn)生的結(jié)果可能是決定性的。在大多數(shù)散發(fā)性腫瘤生長的早期，突變發(fā)生形成選擇性優(yōu)勢，引起腫瘤細(xì)胞瘋狂增長。由于人體本身的復(fù)雜性，這方面的研究大多通過比較病例——對照研究中的病例和對照之間的差異，找出SNP等遺傳因素差異，指導(dǎo)疾病預(yù)防和治療。考慮到其它因素的影響，不同的研究者可能會得到不同的結(jié)論，引起爭議。以GSTM1為例，臨床研究指出，GSTM1缺失可能和癌癥發(fā)生率的升高有關(guān);但是，另外一些研究表明，完整GSTM1基因的存在可能對細(xì)胞發(fā)生的損害［1］和DNA加合物的生成［2-3］有保護(hù)作用。因此，以往的研究更關(guān)注個體先天的基因多態(tài)性對疾病易感性的決定作用。研究者雖然知道先天的基因多態(tài)性決定的主要是個體對環(huán)境物質(zhì)攻擊DNA時的保護(hù)作用，而發(fā)生在基因上的體細(xì)胞突變才是疾病發(fā)生發(fā)展的真正原因;但是，限于研究手段只能對DNA加合物的檢測分析，很難直接涉及體細(xì)胞突變的情況，甚至很多學(xué)者忽視體細(xì)胞突變的存在。他們認(rèn)為，如果存在體細(xì)胞突變，那么DNA指紋技術(shù)還能用于個體鑒別嗎?這個問題困惑學(xué)術(shù)界很多年。相信，隨著近年測序技術(shù)的快速發(fā)展，對同一個體的不同組織進(jìn)行全基因組測序時，這其中的奧秘定能揭示。

2 自身不同組織的基因序列比對可以檢測體細(xì)胞突變的位點(diǎn)

2010年，英國劍橋桑格實(shí)驗(yàn)中心在《Nature》發(fā)表了2篇重要論文［4-5］，一篇對屬于同一個體的肺癌細(xì)胞和皮膚細(xì)胞進(jìn)行了全序列測定，比較發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞存在22910 個突變;另一篇描述了黑色素瘤細(xì)胞與來自同一個體的淋巴細(xì)胞的全序列結(jié)果，比較發(fā)現(xiàn)了33345 個突變。他們提出雖然有上萬的體細(xì)胞突變，只有小部分是肇事突變(driver mutation)，大部分是與疾病發(fā)生發(fā)展無關(guān)的無關(guān)突變(passenger mutation)。之后的2年多，這個領(lǐng)域的研究如雨后春筍，腦瘤、白血病、卵巢癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、肝癌、腎癌、肺癌［6-12］等都完成了腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的同個體對照全基因組測序，發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變數(shù)量基本在幾萬這樣一個區(qū)間。這正好回答了讓學(xué)術(shù)界困惑多年的問題:體細(xì)胞突變確實(shí)存在，只是有限的數(shù)量與基因組總量相比是很小的比例，雖然其不影響個體鑒別，卻實(shí)實(shí)在在是引起疾病的元兇。

人一生長期與環(huán)境互相作用，有些DNA首先發(fā)生體細(xì)胞突變，這個突變位點(diǎn)會在其分裂生成的子代細(xì)胞中得到遺傳，被稱為體細(xì)胞遺傳。不斷的突變，不斷的細(xì)胞分裂，體細(xì)胞突變會在細(xì)胞中積累，年齡越大積累的體細(xì)胞突變越多，造成組織內(nèi)部細(xì)胞擁有一群一群的單克隆。2011年，Gaisa等［13］對膀胱上皮細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其擁有多個單克隆族群。每一個族群內(nèi)部擁有相同的基因序列，而族群之間在某些基因上可發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的體細(xì)胞突變特征。Kan等［14］的研究顯示，腫瘤的體細(xì)胞突變在患者中具有多樣性，并帶來了發(fā)生發(fā)展過程中的差異;同時發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞突變雖然發(fā)生在同一個基因上，卻分散在不同的位置，說明體細(xì)胞發(fā)生的隨機(jī)性。Si等［15］對432例中國黑色素瘤患者進(jìn)行了BRAF和NRAS的基因測序，發(fā)現(xiàn)基因上有些位置如BRAF V600E是高頻突變位點(diǎn)，稱為突變熱點(diǎn)(hot spots)，有89個樣本在這個位點(diǎn)有突變。而其他多數(shù)體細(xì)胞突變卻只在1個樣本中檢測得到，更說明了體細(xì)胞突變的隨機(jī)分布性質(zhì)。Morin等［16］對非霍奇金淋巴瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，在組蛋白修飾基因上的高頻率體細(xì)胞突變。2012年，Hodis等［17］對大規(guī)模黑色素瘤的外顯子數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了6個異常的黑色素瘤相關(guān)基因(PPP6C、RAC1、SNX31、TACC1、STK19 和 ARID2)，其中RAC1、PPP6C和 STK19基因擁有頻發(fā)性。這種肇事突變組合的研究為黑色素瘤形成過程中紫外線的直接誘變作用提供了明確的基因組學(xué)證據(jù)。Stephens等［19］對100個乳腺癌樣本進(jìn)行了全基因測序，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本之間在體細(xì)胞突變的分布上差異性很大，還發(fā)現(xiàn)患者年齡越大，體細(xì)胞突變的數(shù)量越多。這個現(xiàn)象符合體細(xì)胞發(fā)生的隨機(jī)性和在子代細(xì)胞中積累的特性。通過對大量測序結(jié)果中肇事突變的分析，發(fā)現(xiàn)了9個乳腺癌相關(guān)的基因AKT2、ARID1B、CASP8、CDKN1B、MAP3K1、MAP3K13、NCOR1、SMARCD1和 TBX3。

上述研究結(jié)果說明，對于一個細(xì)胞來說肇事突變或肇事突變組合的形成是一個偶然事件，一旦發(fā)生會讓細(xì)胞發(fā)生異化。異化了的細(xì)胞如果能夠遵循體內(nèi)“細(xì)胞社會”的規(guī)則，就會選擇凋亡，從而個體組織正常發(fā)展。如果異化細(xì)胞逃脫凋亡以及體內(nèi)免疫監(jiān)視，則形成異常細(xì)胞群，進(jìn)而影響組織、器官，發(fā)生疾病。很多疾病如腫瘤、糖尿病、高血壓和阿爾茨海默病等都有這樣的一個發(fā)生發(fā)展的過程。

3 靶向藥物的個性化方案是治愈難治性疾病的鑰匙

難治性疾病如腫瘤、高血壓、糖尿病等，都有癥狀表現(xiàn)相似而發(fā)病機(jī)制完全個性化的特點(diǎn)。目前開發(fā)新藥做臨床試驗(yàn)時，這類疾病的新藥有效率總體不高，原因不是這些新藥有效性差，而是參與新藥試驗(yàn)的患者疾病類型多樣，有些疾病類型尚未知曉。因此，新藥針對的患者表現(xiàn)出療效，不針對的患者無效。隨著疾病機(jī)制研究的深入，很多用于開發(fā)新藥的靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)這些靶標(biāo)理性設(shè)計的新藥除了毒性難于預(yù)測外，有效性還是有把握的。目前，靶向新藥越來越有針對性，這樣就要求研究者從臨床試驗(yàn)到實(shí)際使用，都應(yīng)該細(xì)分患者與疾病的類型。以往的個性化醫(yī)療，重點(diǎn)表現(xiàn)在對患者的個性化，如年齡、性別、有否吸煙等外在因素，以及靶標(biāo)基因多態(tài)性和代謝分布基因多態(tài)性等內(nèi)在因素。而根據(jù)體細(xì)胞突變原理設(shè)計的藥物使用個性化，更注重針對疾病細(xì)胞的體細(xì)胞突變多樣性。

2010 年，Alberto 和 Atanasio［19］強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞本身的基因組學(xué)改變是決定腫瘤個性化治療中的重要因素。梳理了大量已經(jīng)上市和正在研究中的靶向藥物，提出這些藥物的正確使用，必須建立在腫瘤基因組信息的分析基礎(chǔ)之上。將來對難治性腫瘤的治療方案應(yīng)該是根據(jù)腫瘤細(xì)胞的基因組特點(diǎn)，復(fù)方使用多個靶向藥物，殺死全部腫瘤細(xì)胞。2011年，Picker和 Jackson［20］梳理了腫瘤治療中的個體化因素，首先是先天的基因多態(tài)性決定了個體對藥物處置上的差異，如藥物代謝酶的基因多態(tài)性、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性等;然后是后天的腫瘤細(xì)胞上的體細(xì)胞突變，決定了腫瘤的類型及其對藥物的敏感性和耐藥性。2011年，Swords等［21］分析了針對白血病的個性化醫(yī)療，主要思想也是根據(jù)腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變結(jié)合表達(dá)譜的改變，制訂個性化治療方案。2011年，Dienstmann等［22］評估了在小細(xì)胞肺癌治療中腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變測定對臨床治療效果的貢獻(xiàn)。2012年8月，Muller等［23］提出了無關(guān)體細(xì)胞突變也是可以用于腫瘤個性化治療的思路。2012年Iyer等［24］對膀胱癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了全基因組測序，找到了17136 個體細(xì)胞突變;經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其TSC1基因有一個丟失了2個核苷酸的體細(xì)胞突變，這個突變造成讀碼位移，從而提高了患者對靶向mTORC1新藥Everolimus的敏感性。

綜上，①不同的腫瘤有著不同的體細(xì)胞突變;②即使是同樣的腫瘤臨床類型，不同個體有不同的體細(xì)胞突變;③大量個體樣本的測序結(jié)果可以用來歸納哪些是肇事突變，哪些是無關(guān)突變;④肇事突變的確認(rèn)可以用于腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究;⑤體細(xì)胞突變類型才是腫瘤分類的真正和實(shí)用的依據(jù);⑥無論是肇事突變還是無關(guān)突變都可能是個性化治療腫瘤的生物標(biāo)志物;⑦上述研究主要涉及腫瘤，其實(shí)常見的難治性疾病，如高血壓、糖尿病等都有類似的體細(xì)胞突變的積累導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展的過程。因此，可以預(yù)見在不遠(yuǎn)的將來，基因測序會變成常規(guī)性的臨床檢測技術(shù)，對人生不同時期、不同組織樣本全基因組測序會提供個體健康狀況的信息，更會對目前的難治性疾病制訂有效的個性化治療方案。

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