張 琳，張福成，王朝虹，蔣 曄＊，許 萌，李 虹

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.空軍總醫(yī)院，北京 100142；

3.最高人民檢察院司法鑒定中心，北京 100040；4.云南省公安廳刑警總隊，云南 昆明 650000）

麻黃堿和N-甲基麻黃堿具有擴張支氣管、抗過 敏和鎮(zhèn)咳作用，是感冒藥中的常見成分。其中，麻黃堿具有較強的興奮作用［1］，是國際奧委會嚴格禁止的興奮劑。因此，體育賽事前確定運動員是否攝取該類藥物時，常需進行尿樣等生物檢材的檢測。對于具有器質(zhì)性心臟病的人員，服用含麻黃堿的制劑還可引起意外心律紊亂而致死。此外，二者還是制造苯丙胺類毒品的主要原料，從吸毒人員體內(nèi)采集的血樣、尿樣及毛發(fā)等生物檢材中檢測該類物質(zhì)是刑偵機構(gòu)立案的重要依據(jù)。因此，建立快速、靈敏的生物樣品中痕量麻黃堿分析方法，可大大延長生物檢材的檢測周期，用于追溯特殊人群的用藥史，對于藥物的安全使用具有重要意義。

生物檢材成分復(fù)雜而待測物含量往往較低，因此常需對生物樣品中的待測物進行提取、純化和富集，以提高檢測靈敏度。已報道的生物樣品前處理方法有稀釋法［2］、蛋白沉淀法［3］、液相萃取法［4-11］、中空纖維液相微萃取法［12］、衍生化法［13-15］、超濾法［16］等。但這些方法均存在一些缺點:稀釋法嚴重污染色譜系統(tǒng)；蛋白沉淀法會導(dǎo)致樣品稀釋，檢測靈敏度降低；液相萃取操作繁瑣；衍生化法往往受到衍生化效率的限制；中空纖維微液相萃取法的重現(xiàn)性較差；而超濾法存在濃差極化現(xiàn)象，導(dǎo)致測定結(jié)果失真。此外，文獻［17-19］報道了用固相萃取-液相色譜-質(zhì)聯(lián)用的方法檢測生物樣品中的麻黃堿，檢測靈敏度為0.1～1μg／L，對未及時取樣且濃度極低的樣品往往無法獲得滿意的分析結(jié)果。因此，本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（SPE-UPLC-ESI MS／MS）聯(lián)用技術(shù)同時定量測定尿樣中的痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿。該方法能有效提取、純化和富集待測物，靈敏度高，結(jié)果準確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高相液相色譜儀，Xevo TQ-MS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀和MasslynxTM工作站（美國Waters公司）。Milli-Q超純水制造系統(tǒng)（美國Millipore公司）；固相萃取儀（美國 Waters公司），Oasis HLB和Oasis MCX固相萃取柱（1mL，30mg；美國 Waters公司）。

鹽酸麻黃堿（批號:171241- 200404）和鹽酸甲基麻黃堿（批號:171247- 200301）對照品購于中國藥品生物制品檢定所，純度均大于99.5%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 尿樣前處理

尿樣采自健康受試志愿者。精密吸取4mL尿液置于離心管中，加入200μL 5mol／L鹽酸溶液酸化，在離心力8000g條件下離心5min。取上清液過MCX固相萃取柱（預(yù)先分別用1mL甲醇和1 mL水活化、平衡），依次用1mL 0.1mol／L鹽酸溶液、1mL甲醇和1mL 5%（體積百分數(shù)，下同）氨水溶液淋洗，用1mL甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液洗脫，接收洗脫液，待UPLC-ESI MS／MS分析。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH Phenyl色譜柱（10cm×2.1mm，1.7μm）；流動相 A為乙腈，流動相B為0.3%甲酸溶液。洗脫梯度:0～3min，流動相A比例由10%升至55%，4min時升至90%，4.1min降至10%，保持1.9min。流速:0.4mL／min；柱溫:35℃；樣品室溫度:10℃；進樣體積:2μL。

電噴霧離子源正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細管電壓:3.0kV；離子源溫度:300℃；去溶劑溫度:500℃，去溶劑氣流量:1000L／h；錐孔氣流量:30L／h；碰撞氣流量:0.15mL／min。待測物的監(jiān)測離子及駐留時間、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS／MS parameters of ephedrine and N-methylephedrine

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

在1.3節(jié)的條件下，混合對照品溶液、空白尿樣和口服急支糖漿制劑7d后的尿樣分別經(jīng)Oasis MCX固相萃取后的UPLC-MS／MS譜圖見圖1?？瞻啄驑又胁缓郎y物，且空白基質(zhì)對待測物的測定無干擾。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

近年來，采用離子對色譜法分析檢測生物堿的報道較多［17］，但這給質(zhì)譜檢測帶來困難。本文在酸性流動相（流動相B為0.1%甲酸溶液）條件下，分別考察了 HSS SB（5cm）、BEH C18（10cm）、CSH C18（5cm）、BEH Phenyl（10cm）4種色譜柱（柱內(nèi)徑均為2.1mm，填料粒徑均為1.7μm）對待測物靈敏度和分離度的影響（見圖2）。結(jié)果表明，以BEH Phenyl色譜柱為分離柱時，待測物的靈敏度較高，且分離度較好。

圖1 （a）混合對照品溶液（1μg／L）、（b）空白尿樣和（c）口服急支糖漿制劑7 d后的尿樣分別經(jīng)MCX柱固相萃取后的UPLC-MS／MS定性和定量離子流譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS qualitative and quantitative ion current chromatograms of（a）mixed standard solution（1μg／L），（b）human blank urine，and（c）urine after 7 d administering Jizhi Syrup extracted by MCX solid phase extraction＊quantitative ion.

圖2 不同色譜柱對待測物靈敏度的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the sensitivity of the analytes

2.2.2 流動相的選擇

以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱，分別考察了酸性流動相（流動相B為0.1%甲酸溶液）和堿性流動相（流動相B為10mmol／L碳酸氫銨溶液，pH 10）對待測物靈敏度及峰形的影響（見圖3）。結(jié)果表明，待測物在酸性流動相下的靈敏度略高于堿性流動相，最終選擇酸性流動相。

圖3 不同流動相對待測物靈敏度的影響Fig.3 Effect of different mobile phases on the sensitivity of analytes

圖4 不同甲酸濃度對待測物靈敏度的影響Fig.4 Effect of different volume percentages of formic acid on the sensitivity of analytes

2.2.3 甲酸濃度的選擇

酸性流動相中甲酸的濃度不同，對待測物靈敏度及峰形有不同程度的影響，因此以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱，分別考察了0.1%甲酸溶液和0.3%甲酸溶液作為流動相對待測物靈敏度的影響（見圖4）。結(jié)果表明，以0.3%甲酸水溶液作為流動相時，待測物的靈敏度較高，且峰形較好，最終選擇在酸性流動相中添加0.3%的甲酸。

2.3 樣品前處理條件的選擇

2.3.1 固相萃取柱的選擇

由于待測組分呈堿性，在反相色譜填料上的保留很弱，因此很難利用一般的固相萃取小柱達到萃取的目的。本文考察了含有吸附性填料的Oasis HLB固相萃取柱和兼具離子交換和反相保留的Oasis MCX固相萃取柱對樣品的提取凈化效果。在不含待測物的空白尿中分別添加0.0250、0.250和2.50μg／L的混合標準溶液，按1.2節(jié)的方法處理樣品，在1.3節(jié)的條件下進行測定，比較樣品的基質(zhì)效應(yīng)（見表2）。

結(jié)果表明，HLB柱作為萃取柱會產(chǎn)生嚴重的離子抑制效應(yīng)，影響檢測靈敏度和準確度，故選擇MCX柱作為固相萃取柱。

2.3.2 洗脫條件的選擇

表2 Oasis HLB與Oasis MCX固相萃取柱萃取效果的比較（n＝6）Table 2 Comparison of the extraction efficiencies of Oasis HLB and Oasis MCX SPE columns（n＝6）

為了使待測物在固相萃取柱上得到最好的保留，上樣前需要對樣品進行酸化以保證待測組分的完全離子化。試驗表明，4mL尿液中加入200μL 5 mol／L的鹽酸溶液可保證待測組分完全吸附在填料上。尿液等生物樣品基質(zhì)非常復(fù)雜，采用質(zhì)譜檢測時基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的準確性影響很大。為了盡可能地去除基質(zhì)，本實驗采用酸洗、醇洗和堿洗三步清洗，選擇性除去非極性的中性物質(zhì)、酸性以及極性堿性干擾物，最后采用堿性的甲醇溶液進行洗脫?？疾炝瞬煌壤募状?氨水溶液的洗脫能力。結(jié)果表明，以甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液作為洗脫液時，待測物的回收率最高，故選擇其作為洗脫液。

2.4 線性范圍和檢出限

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100μg／L的混合對照品溶液和內(nèi)標氘代苯丙胺質(zhì)量濃度為10μg／L的對照品溶液。吸取上述系列濃度對照品溶液各250μL至7個離心管中，分別加入250μL內(nèi)標溶液，最后用空白尿稀釋至10mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.0500、0.125、0.250、0.500、1.25、2.50μg／L 的樣品溶液。按1.2節(jié)的方法處理樣品，按1.3節(jié)的條件進樣測定，記錄峰面積。以待測物與內(nèi)標峰面積比（Y）對質(zhì)量濃度（C，μg／L）進行線性回歸，得到麻黃堿和N-甲基麻黃堿在0.0250～2.50μg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性方程分別為Y＝8.12C-0.143（r＝0.9998）和 Y ＝4.09C＋0.735（r＝0.9992）。取線性最低點溶液逐倍稀釋，按1.3節(jié)的條件進樣測定，得麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢出限 均 為 0.01 μg／L （S／N ＝ 3），均高于文獻［5-7，12，14-17，19］報道。

2.5 精密度、準確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg／L的質(zhì)控（QC）樣品，每個濃度6份，按1.2節(jié)的方法處理樣品，在1.3節(jié)的條件下進行測定，記錄峰面積As，計算日內(nèi)精密度和準確度；連續(xù)測定3d，計算日間精密度。同時，取空白尿，按1.2節(jié)的方法處理后，配制成低、中、高3個濃度的溶液，每個濃度6份，在1.3節(jié)的條件下進行測定，記錄峰面積Am；另取上述3個濃度的對照品溶液，不經(jīng)萃取直接進樣，記錄峰面積為Astd。以As／Am計算提取回收率，Am／Astd計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。

表3 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的精密度、準確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率（n＝6）Table 3 Precisions，accuracies，matrix effects and recoveries of ephedrine and N-methylephdrine（n＝6）

2.6 樣品穩(wěn)定性

配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg／L的質(zhì)控樣品，每個濃度3份。將上述樣品于室溫放置24h及經(jīng)過3次凍融循環(huán)后，按1.2節(jié)方法處理，并在1.3節(jié)的條件下進行測定，考察其短期穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性（見表4）。結(jié)果表明，麻黃堿和N-甲基麻黃堿在上述條件下均穩(wěn)定。

表4 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的穩(wěn)定性（n＝3）Table 4 Stabilities of ephedrine and N-methylephedrine（n＝3）

2.7 真實樣品測定

采集健康志愿者口服10mL急支糖漿制劑7d后的尿樣，按1.2節(jié)方法處理樣品，并按1.3節(jié)的條件進行測定，尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)量濃度分別為0.034和0.137μg／L。表明該方法能夠有效測定尿樣中痕量的麻黃堿和N-甲基麻黃堿，大大提高檢測靈敏度，并延長了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測周期。

3 結(jié)論

本實驗采用Oasis MCX固相萃取柱對尿樣進行提取、純化和富集，建立了SPE-UPLC-ESI MS／MS方法分析尿樣中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿，顯著提高了檢測靈敏度，大大延長了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測周期，為未及時取樣且濃度極低的樣品中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測提供了有效的方法。

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