何泳潔，曹碧蘭，汪治國，陳曉紅，曾 霓，顏廷凱，孫文倩，陶 銳

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；2.成都市第五人民醫(yī)院 皮膚科，四川 成都 611130；3.咸寧市中心醫(yī)院同濟(jì)咸寧醫(yī)院市皮膚科，湖北 咸寧 437100)

皮膚疣自體植入療效與HPV型別的關(guān)系

何泳潔1，2，曹碧蘭1，汪治國3，陳曉紅1，曾 霓1，顏廷凱1，孫文倩1，陶 銳1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；2.成都市第五人民醫(yī)院 皮膚科，四川 成都 611130；3.咸寧市中心醫(yī)院同濟(jì)咸寧醫(yī)院市皮膚科，湖北 咸寧 437100)

目的通過TSP-PCR技術(shù)，檢測本地區(qū)皮膚疣患者(尋常疣、跖疣和扁平疣)感染HPV的型別，探討皮膚疣自體植入療效與HPV型別的關(guān)系。方法收集皮膚疣患者149例，通過皮膚疣自體植入治療，同時取其疣體組織進(jìn)行HPV基因型別檢測。結(jié)果完成隨訪102例患者中HPV檢出率高達(dá)99.02%(101/102)，所設(shè)計的型別均有檢出。其中多種HPV型別檢出率較單一型別多，為58.42%。皮膚疣自體植入療效表明，尋常疣、跖疣和扁平疣治療有效率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.225，P>0.05)。HPV單一和多種型別感染的治療有效率差別無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.422，P>0.05)。<18歲組的治療有效率明顯高于>35歲組；病程<1年組有效率明顯高于病程>3年組。結(jié)論皮膚疣自體植入治療對單一及多種HPV型別感染均有效，對<18歲病程<3年的患者療效較好，對>35歲病程>3年的患者療效較差，這對于臨床早期治療具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)價值。

皮膚疣；自體植入；人乳頭瘤病毒；HPV型別；PCR

皮膚疣是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染所致的常見皮膚病，按其臨床表現(xiàn)和發(fā)病部位不同分為尋常疣、跖疣、扁平疣等[1]，不同類型皮膚疣所感染的HPV型別也有所差異，其中HPV1、2、3、4、7、10、27、28、40、41、57、63和65型為皮膚疣感染的常見型別[1-3]。皮膚疣自體植入療法是一種人工主動免疫方法，對治療皮膚疣效果較好，目前國內(nèi)外報道顯示其治愈率在70%～97%[4-7]。本實(shí)驗(yàn)通過型特異性引物PCR(type specific primer, TSP-PCR)技術(shù)，檢測尋常疣、跖疣和扁平疣患者感染HPV的最常見型別，包括HPV1、2、3、4、7和10型，探討皮膚疣自體植入療效與HPV不同型別的關(guān)系，為臨床療效提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入研究的病例為2007年7月至2011年4月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科門診就診的皮膚疣患者149例，失訪47例，完成隨訪102例。在完成隨訪的病例中，尋常疣31例、跖疣29例、扁平疣42例；男52例，女50例；5～62歲，平均25.21±11.88歲；病程1個月～30年，平均3.94±5.31年；<18歲的27例，18～35歲的54例，>35歲的21例；病程<1年的38例，1～3年的29例，>3年的35例。每位患者疣體數(shù)8～200個。入選患者3個月內(nèi)未接受干擾素、胸腺肽及IL-2等抗病毒及免疫調(diào)節(jié)劑治療，伴有自身免疫性疾病及嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病者除外。扁平疣樣本取材于面部和手背，少部分為頸部和前臂；尋常疣樣本取材于手背、手指和足緣；跖疣樣本取材于足底。

1.2 樣本采集 選擇患者新生疣體，常規(guī)消毒后用2%利多卡因局部浸潤麻醉，削去表皮角質(zhì)層，切取米粒大小疣體兩份，一份用于植入治療，另一份置于裝有生理鹽水的1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.3 皮膚疣自體植入治療方法 將切取的其中一份米粒大小疣體組織剪成M型(增大疣體與機(jī)體接觸面積)，用生理鹽水沖洗后置入75%乙醇中浸泡20 min，放入生理鹽水中備用，在上臂三角肌或前臂屈側(cè)部位，常規(guī)消毒及局麻后切開皮膚達(dá)脂肪層，長0.5～1.0 cm，眼科無齒鑷沿切口一側(cè)做鈍性分離，使皮下形成一個小間隙，將備用M型疣體植入皮下，用0號絲線縫合切口，1周后拆線。第1～3月每2周隨訪1次，第3～6月每月隨訪1次，觀察療效；之后每半年隨訪1次，了解復(fù)發(fā)情況。

1.4 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 疣體全部消退判定為痊愈；疣體較前變平、消退70%以上判定為顯效，痊愈和顯效均判定為有效；術(shù)后6個月，疣體消退仍不足70%或未見消退判定為無效。

1.5 HPV分型方法(見表1)

1.5.1 標(biāo)本DNA提取 按照AxyPrep基因組DNA小量試劑盒說明書提取DNA，抽提的DNA置于-20 ℃保存，用于TSP-PCR擴(kuò)增。

1.5.2 TSP的設(shè)計 所用HPV1、2、3、4、7和10型的TSP，均由上海生工公司按表1方案設(shè)計合成。

1.5.3 TSP-PCR反應(yīng)酶系統(tǒng)為美國Promega公司的GoTaq@Master Mixes，采用50 μL體系，按說明書加Taq Mix25 μL，引物各1 μL(10 μM)，DNA模板2 μL，加去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR儀為美國Bio-Rad公司C1000TMThermal Cycler梯度PCR擴(kuò)增儀。最佳反應(yīng)條件為95℃，預(yù)變性5 min，35個循環(huán)(95 ℃，30 s，50～60 ℃，30 s，72 ℃，30 s)，72 ℃延伸5 min。

1.5.4 PCR產(chǎn)物的半定量分析 ①瓊脂糖凝膠電泳:配置2%瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增產(chǎn)物分別取5 μL于80V、50mA條件下進(jìn)行電泳45 min；②產(chǎn)物分析:在凝膠分析系統(tǒng)上進(jìn)行攝像，分別對得到的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶長度進(jìn)行分析，判斷是否為HPV型別的目的條帶。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。按α=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多組間有差異時所選用的兩兩比較方法。

表1 HPV分型設(shè)計使用的特異性引物[8-9]

HPV型別引物序列產(chǎn)物長度/bp退火溫度/℃HPV15-AATARGTTWGATGATGCWGAA-35-AKRTARTCWGGATATTTGCA-3309～32850HPV25-GGGGATATGGTTGAAACAGGT-35-CAGAGGACACCATAGAGCCA-329457HPV35-AACTCTAAYATWGCACATG-35-CAVGTRCSYTGGCAAATATC-327355HPV45-GGAGATACAGAAAATCCT-35-SHATCTCCATAGATATCTTT-3330～33550HPV75-GTGTGATACTCCCTTGCACTC-35-GGAACTTTGACCTAGCAATTTG-341755HPV105-ATGTCCATGGGTGCACAGGAA-35-CTGTGGGATGCGGACCGTGCA-344460

注：表中H=A、T或C；K=G或T；R=A或G；S=C或G；W=A或T；Y=T或C。

2 結(jié)果

2.1 TSP-PCR結(jié)果 ①在102例皮膚疣樣本中，TSP-PCR陽性101例(見表2)，HPV感染檢出率99.02%;②設(shè)計的6種HPV型別均有檢出(見表2、圖1)。尋常疣、跖疣以HPV2、1和4型感染為主，扁平疣以HPV2、10、3和1型為主；③陽性標(biāo)本中，有42例(41.58%)為單一HPV型別感染；有59例(58.42%)同時存在2～4種HPV型別感染(見表3與圖2～4)，其中二重感染34例(33.67%)，三重感染21例(20.79%)，四重感染4例(3.96%)；多種HPV型別感染的組合趨于多樣化，以HPV1+2型最多(20例)，其次為HPV1+2+10型(8例)；④新發(fā)現(xiàn)尋常疣感染HPV3和10型，扁平疣感染HPV7型。

表2實(shí)驗(yàn)組樣本HPV型別感染情況

病 種例數(shù)HPV1HPV2HPV3HPV4HPV7HPV10尋常疣3112251703跖 疣2921220200扁平疣421633211223總 計10249(48．04)80(78．43%)22(21．57%)10(9．80%)2(1．96%)26(25．49%)

表3單一和多種HPV型別感染情況

病 種HPV型別單一型別感染1(9)，2(23)，3(3)，4(3)，10(4)多種型別感染1+2(20)，2+10(5)，2+3(4)，1+3(1)，2+4(3)，1+10(1)，1+2+10(8)2+3+10(4)，1+2+3(4)，1+2+4(3)，2+3+7(2)，1+2+3+10(3)，2+3+4+10(1)

圖1 HPV1、2、3、4、7和10型的TSP-PCR陽性結(jié)果

圖2 1例尋常疣同時感染HPV1和2型的TSP-PCR陽性結(jié)果

圖3 1例扁平疣同時感染HPV2、3和7型的TSP-PCR陽性結(jié)果

2.2 皮膚疣自體植入治療結(jié)果

2.2.1 尋常疣組、跖疣組和扁平疣組3組患者，經(jīng)皮膚疣自體植入治療其有效率分別為70.97%(22/31)、75.86%(22/29)和71.43%(30/42)(見表4)。3組之間療效差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.225，P>0.05)。

表4皮膚疣自體疣植入療效比較

病 種例數(shù)有效無效有效率/%尋常疣3122970．97跖疣2922775．86扁平疣42301271．43合計102592872．55

2.2.2 單一和多種型別HPV感染療效比較 單一型別HPV感染治療的有效率為78.57%(33/42)，而多種型別感染的有效率為67.80%(40/59)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.422，P>0.05)。

2.2.3 不同性別療效比較 男性患者有效率為69.23%(36/52)，女性患者有效率為76.00%(38/50)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.586，P>0.05)

2.2.4 不同年齡段療效比較 <18歲組、18～35歲組與>35歲組有效率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.864，P<0.05)。其中年齡<18歲組有效率為92.59%(25/27)，明顯高于18～35歲組70.37%(38/54)和>35歲組的有效率52.38%(11/21)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.143、10.187，P均<0.05)，但18歲～35歲組與>35歲組的有效率差異不顯著(χ2=2.142，P>0.05)。

2.2.5 不同病程療效比較 病程<1年組、1～3年組與>3年組3組間有效率比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.346，P<0.05)。病程<1年組的有效率為92.11%(35/38)，明顯高于1～3年的有效率68.97%(20/29)及>3年組的有效率54.29%(19/35)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.990，P<0.05)，但病程1～3年組有效率與>3年組的有效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.785，P>0.05)。

2.3 不良反應(yīng)和復(fù)發(fā)情況 尋常疣和跖疣患者疣體脫落過程表現(xiàn)為脫屑、疣體逐漸萎縮、變平至脫落，個別患者疣體脫落前可出現(xiàn)瘙癢、疼痛。扁平疣患者疣體脫落前多有局部發(fā)紅、瘙癢或疣體增多、增大現(xiàn)象，隨后1～2周內(nèi)疣體逐漸脫落。3組患者疣體切取和植入部位均無明顯瘢痕和感染等不良反應(yīng)。對74例治療有效的患者隨訪1～3年，僅1例跖疣患者術(shù)后5個月時復(fù)發(fā)，有15例隨訪3年以上，均未見復(fù)發(fā)。

3 討論

以往關(guān)于HPV型別的研究大多集中在粘膜或生殖器疣，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展特別是PCR的應(yīng)用，與皮膚疣相關(guān)的HPV型別逐漸被揭示，且皮膚疣HPV型別與生殖器疣存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)采用TSP-PCR擴(kuò)增，HPV檢出率高達(dá)99.02%，單一型別HPV檢出率為41.58%，多種型別HPV檢出率為58.42%。所設(shè)計的目標(biāo)類型HPV1、2、3、4、7和10型，在尋常疣、跖疣和扁平疣中均各自分別有不同程度的檢出。尋常疣、跖疣感染型別主要為HPV2、1和4型，扁平疣感染型別主要為HPV2、10、3和1型，其中HPV2型感染率最高。另外，相對單一型別HPV的檢出率，多種型別檢出率更高，且組合方式呈現(xiàn)出多樣化的趨勢。HPV的多重感染以往文獻(xiàn)中也有報道，特別是在尖銳濕疣和宮頸癌中報道相對較多。李娟、宋守榮等[10]檢測貴陽地區(qū)60例尖銳濕疣HPV型別，結(jié)果HPV混合感染率為80%，以HPV6+11或兩者與HPV16、18混合感染為主，并認(rèn)為混合感染率較高可能與地區(qū)、人群差異有關(guān)。彭方毅等[11]報道在喉癌中也存在HPV感染，利用6對TSP聯(lián)合基因測序發(fā)現(xiàn)，大多特異型別均與HPV16型同時存在于同一病例中。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中HPV16、18和33型常有二重感染，特別是HPV16為二重感染中最常見的型別，認(rèn)為HPV多重感染與HPV某些特異型別有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HPV2型可能為遵義地區(qū)皮膚疣感染的優(yōu)勢基因種族，這可為今后有針對性地研制和應(yīng)用抗皮膚疣HPV疫苗提供有意義的參考。同時，皮膚疣多重感染率高在一定程度上提示在疫苗的研發(fā)時需考慮同時抵抗多種型別的HPV感染。

臨床上應(yīng)用皮膚疣自體植入療法已有20余年，以往研究表明機(jī)體感染HPV后病毒樣顆粒僅見于顆粒層和角質(zhì)層，HPV抗原與免疫細(xì)胞接觸機(jī)會少，感染局部的抗原信號弱，因此增加HPV抗原與機(jī)體免疫細(xì)胞接觸機(jī)會對于打破HPV感染的免疫耐受非常重要。該療法利用自身疣體組織經(jīng)嚴(yán)格消毒處理后植入自身皮下，作為一種抗原進(jìn)入機(jī)體后使T細(xì)胞致敏，致敏的T細(xì)胞識別抗原遞呈細(xì)胞遞呈的MHC-抗原復(fù)合物(第一活化信號)，并在協(xié)同刺激信號(第二活化信號)作用下，T細(xì)胞活化、增殖、分化成針對這一特定抗原的致敏淋巴細(xì)胞，進(jìn)而使疣體組織受到排斥而脫落。國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用此療法治療皮膚疣均取得了較好療效[4-7]，本研究結(jié)果對扁平疣、跖疣、尋常疣總有效率為72.55%。

從HPV感染型別的角度分析該方法治療皮膚疣的療效情況，由于單一型別的感染主要集中在HPV2型，某些單一型別感染例數(shù)較少，因此無法對各單一型別間的療效進(jìn)行比較。而多種型別HPV感染呈現(xiàn)多樣化，每種組合方式例數(shù)也均較少，故也未對多種型別HPV感染與療效之間比較，本文僅分析單一型別與多種型別HPV感染的療效，結(jié)果顯示兩者間無明顯差異，表明該療法不僅對某種特定的HPV型別感染有效，而且對不同型別HPV感染均有效。原因可能與實(shí)驗(yàn)樣本容量不夠大因而掩蓋了它們之間的差異性有關(guān)；從另一方面看，這或許暗示著各種皮膚疣HPV型別之間由于同源性可能本質(zhì)上存在非常類似或者相同的自身免疫應(yīng)答機(jī)制，值得深入探討。從患者年齡及病程情況分析，<18歲組的治療有效率明顯好于18～35歲組和>35歲組，病程<1年組的明顯高于1～3年及>3年組。這可能與機(jī)體在不同的年齡段，對抗原刺激所產(chǎn)生的敏感性及耐受性不同，自體免疫反應(yīng)程度的強(qiáng)弱亦有所不同有關(guān)；而病程>3年組療效相對較差，是否與機(jī)體的免疫耐受或病毒毒力減弱未刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。皮膚疣自體植入療效與患者年齡和病程之間明顯的依賴關(guān)系，對于皮膚疣患者的臨床早期治療具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)價值。

[1] 趙辨.中國臨床皮膚病學(xué)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010:413-418.

[2]Jablonska S,Orth G.Cutaneous warts:clinical histological and virological correlations [J].Arch Dermatol Res,1995, 287(6),616-618.

[3]Bernard HU.The clinical importance of the nomenclature,evolution and taxonomy of human papillomaviruses [J].J Clin Virol,2005,32(5):1-6.

[4]Shivakumar V,Okade R,Raikumar V.Autoimplantation therapy for multiple warts [J].Indian J Dermatol Venereol Leprol,2009,75(6):593-595.

[5]Srivastava P K,Bajaj A K.Autowart injection therapy for recalcitrant warts [J].Indian J Dermatol,2010,55(4):367-369.

[6]張戰(zhàn)勝.自體疣皮下包埋治療掌跖疣1894例[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2004,18(12):710.

[7]曹碧蘭,郭瑞珍,肖慶邦,等.自體疣植入治療扁平疣及相關(guān)機(jī)制[J].中華皮膚科雜志,2004,37(9):525-527.

[8]Harwood C A,Spink P J,Surentheran T,et al.Degenerate and nested PCR:a highly sensitive and specific method for detection of human papillomavirus infection in cutaneous warts[J].J Clin Microbiol,1999,37(11):3545-3555.

[9]Lei Y J,Wang C,Gao C,et al.HPV-2 Isolates from Patients with Huge Verrucae Vulgaris Possess Stronger Promoter Activities[J].Intervirology,2007,50(5):353-360.

[10]李娟,宋守榮,魏羽佳,等.尖銳濕疣66例HPV檢測及基因分型分析[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(2):142-145.

[11]彭方毅，姜海蓉，劉芳,等.喉癌中HPV不同型別的檢測及測序[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009,34(12):1689-1692.

[12]Del Anlo J,Gonzalez C,Losana J,et al.Influence of age and geographical origin in the prevalence of high risk human papillomavirus in migrant female sex workers in Spain[J].Sex Transm Infect,2005,81(1):79-84.

[收稿2013-02-12;修回2013-04-18]

(編輯：譚秀榮)

TherelationshipsbetweenthecurativeeffectsofAuto-verrucaimplantationandHPVgenotype

Heyongjie1，2,Caobilan1,Wangzhiguo3,Chengxiaohong1,Zengni1,Yantingkai1,Sunwenqian1,Taorui1

(1.Department of Dermatology，The Affiliate Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099，China；2.Department of Dermatology Fifth People’s Hospital of Chengdu，Sichuan Chengdu 611130，China；3.Department of Dermatology，Central Hospital of Xianning，Hubei Xianning 437100，China)

ObjectiveTo detect the HPV genotype of local patients with skin warts, including verruca vulgaris, plantar warts and flat warts, by using the type specificity primer PCR method, and to discuss the relationship between the curative effects of auto-verruca implantation and the HPV genotype.MethodsCollect 149 patients with skin warts from the dermatological department outpatient of Zunyi Medical College affiliated hospital. Take the warts tissue for auto-verruca implantation treatment. Meanwhile, extracting genomic DNA samples from the skin warts, define and analysis the HPV gene sequences and genotype, and discuss the relationship between the curative effects of auto-verruca implantation and the HPV genotype .ResultsComplete the follow-up of 102 patients, it is found that the total detection rate of HPV is 99.02% .And all the type designed was detected out. The most type that detected was multi-infections and the infection rate is 58.42%. The effective rates of auto-verruca implantation to treat verruca vulgaris, plantar warts and flat warts have no statistical significances of the differences(2=0.225，P>0.05). The effective rate between mono-infection and multi-infections have no statistical significances of the differences(2=1.422，P>0.05). The effective rate of patients no more than 18 years old which is obviously higher than that of the patients more than 35 years; the effective rate of patients whose course of disease is more than 3 years which is obviously lower than that of the patients whose course of disease is less than 1 year.ConclusionAuto-verruca implantation is effective not only for the mono-infection of HPV type of skin warts, but also for the HPV multi-infections. The curative effect of auto-verruca implantation is better for the patients whose age is under 18 and whose course of disease is less than 3 years. However, the curative effect was worse of the patients whose age is above 35 and whose course of disease is more than 3 years.It has realistic significance of early treatment for skin warts patients.

skin warts; autoimplantation; human papillomavirus; HPV genetype; PCR

R 76

A

1000-2715(2013)03-0228-05

遵義市科技局資助項(xiàng)目(NO：遵市科合社字200810)。

曹碧蘭，女，主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師，研究方向：皮膚免疫學(xué)，E-mail:caobilan@163.com。