朱順飛，廖珍媛，胡 燕，陳 超，李永菊，劉思靜，羅軍敏，熊思東，徐 林

(1.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系2011級(jí)學(xué)生，貴州 遵義 563099)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究·

微小RNA-7過(guò)表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的影響

朱順飛1，廖珍媛1，胡 燕1，陳 超1，李永菊1，劉思靜2，羅軍敏1，熊思東1，徐 林1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系2011級(jí)學(xué)生，貴州 遵義 563099)

目的探討過(guò)表達(dá)miR-7對(duì)人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的影響。方法將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(命名為p-miR-7)體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺癌95D 細(xì)胞后，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞的體外遷移情況；侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變；建立人肺癌裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，HE染色觀察過(guò)表達(dá)miR-7對(duì)肺部腫瘤轉(zhuǎn)移的影響；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Sema4C蛋白的表達(dá)。結(jié)果過(guò)表達(dá)miR-7可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力(P<0.05)；與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-7組未觀察到明顯的肺部腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶(P<0.05)；免疫熒光結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-7組中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Sema4C蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論過(guò)表達(dá)miR-7可以顯著抑制人肺癌細(xì)胞體外及體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，提示miR-7有望成為肺癌后續(xù)基因治療的新靶點(diǎn)。

肺癌；miRNA-7；轉(zhuǎn)移；侵襲；Sema4C；生物治療

微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)是miRNA家族成員之一，定位于第15號(hào)染色體，已有文獻(xiàn)報(bào)道其可以有效的抑制乳腺癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1-2]。新近研究報(bào)道顯示，miR-7還與肺癌的體外增殖以及臨床化療有關(guān)[3]。然而, miR-7參與調(diào)控肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機(jī)制仍未闡明。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，miR-7模擬物(mimics)可以有效抑制人肺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)[4]。我們成功構(gòu)建了miR-7的真核表達(dá)載體，其可有效表達(dá)miR-7成熟體[5]。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用該真核表達(dá)載體過(guò)表達(dá)miR-7，觀察miR-7對(duì)人肺癌細(xì)胞體內(nèi)、外轉(zhuǎn)移能力的影響，并初步探討miR-7在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的可能作用機(jī)制，為后續(xù)基于miRNAs的肺癌臨床生物治療新靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人源性肺巨細(xì)胞癌95D細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只4周齡雌性BALB/C裸鼠，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640(購(gòu)自Hyclone公司)；PCR試劑和Premix Ex Taq(Takara)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Solarbio)；L-谷氨酰胺(上海政翔化學(xué)試劑研究所)；雙抗(氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素)(上海市第四制藥股份有限公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(invitrogen)；質(zhì)粒pcDNA3.1(-)(invitrogen)；質(zhì)粒小抽提取試劑盒(天根)； SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)和二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀儀器)；IX-51倒置顯微鏡和IX-71倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肺癌95D細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液輔以10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁度達(dá)70%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)并離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL接種于6孔板中備用。根據(jù)脂質(zhì)體2000試劑說(shuō)明書(shū)，分別將pcDNA3.1(-)-p-miR-7重組質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)組：p-miR-7)和pcDNA3.1(-)空白質(zhì)粒(對(duì)照組：p-Cont)分別轉(zhuǎn)染入至95D細(xì)胞。

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-miR-7轉(zhuǎn)染后95D細(xì)胞的體外遷移 將上述各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)6h后，用1 mL槍頭沿板中線刮出2 mm刮痕，PBS洗滌，顯微鏡下觀察確定刮痕內(nèi)無(wú)細(xì)胞后，加上培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入1 mL4%多聚甲醛，固定30 min，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。

2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 取按照Matrigel：培養(yǎng)基(無(wú)血清)=1∶3的比例稀釋的Matrigel 50 μL( 120 μg)加入Trans-well的上室，置37 ℃下60 min 凝聚以形成人工基底膜。將上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞消化處理為細(xì)胞懸液(用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)，分別加入上室中，每室細(xì)胞數(shù)至少在 2×105個(gè), 置 37 ℃、5% CO2全濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，并在Trans-well室的下室加入含10%血清的培養(yǎng)基。取出聚碳酸酯膜，4%多聚甲醛固定20 min；伊紅染色30 min；乙醇梯度逐級(jí)脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。普通光學(xué)顯微鏡下將膜分為9等份，選取4個(gè)旁格和1個(gè)中心格,計(jì)算每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù), 每組計(jì)數(shù)3個(gè)批次的樣品。

2.4 肺癌裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型

2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染技術(shù)步驟同2.1。

2.4.2 尾靜脈注射 根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，24只裸鼠購(gòu)回后于SPF環(huán)境下觀察飼養(yǎng)4周后，編號(hào)并隨機(jī)分為兩組，每組12只: ①觀察各組裸鼠體重變化情況；②觀察裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移；然后將這兩組又分別分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(其中每組6只裸鼠)，分組完成后，分別從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組裸鼠尾部選取較粗的靜脈注射p-Cont空白載體和 p-miR-7重組載體,每只裸鼠注射細(xì)胞懸液約1 mL。接種后每天觀察接種點(diǎn)有無(wú)紅腫破潰，裸鼠的一般狀態(tài)(精神、飲食)。

2.4.3 肺轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè) 從裸鼠尾靜脈接種人肺癌95D細(xì)胞，第28天后,常規(guī)處死兩組裸鼠,解剖后取其肺部組織并肉眼觀察是否有腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成。將裸鼠肺組織放入苦味酸液中固定24 h ,后經(jīng)乙醇梯度逐級(jí)脫水，置于60 ℃蠟盒內(nèi)浸蠟,包埋切片后行蘇木精-伊紅染色,在顯微鏡下觀察其肺組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4.4 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中Sema4C蛋白的表達(dá) 收集95D細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至專用細(xì)胞培養(yǎng)載玻片中培養(yǎng)，并分別轉(zhuǎn)染p-cont空白載體和p-miR-7重組載體，培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染48 h后，做免疫熒光染色，步驟如下：棄去培養(yǎng)液，PBS洗1次，用4%多聚甲醛固定30 min, PBS漂洗3次；加含10%牛白蛋白的PBS封閉1 h, 再用PBS漂洗3次；加入含0.5%Triton-x-100的 PBS進(jìn)行破膜2 min，PBS漂洗3次；滴加Sema4C抗體(稀釋倍數(shù)均為1∶200)，置于4 ℃濕盒中過(guò)夜后，取出用PBS漂洗3次；加入1∶200倍稀釋的羊抗兔-FITC二抗，置于37℃濕盒中避光1 h，用PBS漂洗3次；滴加DAPI染液，染色3 min，接著用PBS漂洗3次；滴加pH7.4 50%的緩沖甘油，蓋上蓋玻片，封片。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察、拍片，并分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p-miR-7抑制95D細(xì)胞的體外遷移 p-miR-7載體轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞后，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力的變化。轉(zhuǎn)染48h后，結(jié)果顯示：與p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-miR-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體外遷移能力受到顯著抑制(見(jiàn)圖1)，提示過(guò)表達(dá)miR-7可抑制95D細(xì)胞的體外遷移能力。

注：Light microscope(Magnification:×100);B:cell Counts;*:Statistical difference. 圖1 轉(zhuǎn)染p-miR-7對(duì)人肺癌95D細(xì)胞的體外遷移的作用(×100)

3.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p-miR-7對(duì)95D細(xì)胞體外侵襲能力的影響 我們進(jìn)一步利用侵襲實(shí)驗(yàn)觀察了腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-miR-7轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的侵襲能力明顯削弱，侵入膠原的細(xì)胞數(shù)量較p-Cont轉(zhuǎn)染組減少約5倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2A、B)，提示過(guò)表達(dá)miR-7可顯著抑制95D細(xì)胞的體外侵襲能力。

注：Light microscope(Magnification:×100);B:cell Counts;*:Statistical difference. 圖2 轉(zhuǎn)染p-miR-7后對(duì)人肺癌95D細(xì)胞體外侵襲的影響

3.3 人肺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型裸鼠的生長(zhǎng)變化 我們進(jìn)一步建立了人肺癌裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，觀察過(guò)表達(dá)miR-7對(duì)裸鼠生長(zhǎng)以及肺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示：p-miR-7轉(zhuǎn)染組裸鼠的飲食和精神狀態(tài)良好；而p-Cont轉(zhuǎn)染組裸鼠飲食下降、精神狀態(tài)差，且體重明顯減輕(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

圖3 各組裸鼠的體重變化

3.4 過(guò)表達(dá)miR-7對(duì)人肺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與p-miR-7轉(zhuǎn)染組相比，p-Cont轉(zhuǎn)染組裸鼠肺部可見(jiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶。鏡下表現(xiàn)為一群細(xì)胞大小不一、核仁明顯、核大并深染的不規(guī)則裸核。而p-miR-7轉(zhuǎn)染組鏡下未觀察到明顯的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶(見(jiàn)圖4)。

注：箭頭示肺部轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。 圖4 裸鼠肺組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×100)

3.5 免疫熒光法檢測(cè)體外各組腫瘤細(xì)胞Sema4c蛋白的表達(dá) 為探討過(guò)表達(dá)miR-7抑制人肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，我們通過(guò)TargetScan軟件和Blast比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Sema4C基因的3’UTR端存在與miR-7結(jié)合的位點(diǎn)。為了明確miR-7是否可以調(diào)控Sema4C的表達(dá)，我們進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染各組中細(xì)胞內(nèi)Sema4C蛋白的表達(dá)情況。激光共聚焦結(jié)果顯示：與p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-miR-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Sema4c蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖5)，提示過(guò)表達(dá)miR-7可抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Sema4C的表達(dá)。

圖5 免疫熒光法檢測(cè)人肺癌細(xì)胞內(nèi)Sema4c蛋白的表達(dá)(×400)

4 討論

新近研究顯示miR-7與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中包括乳腺癌、胃癌、肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，并且對(duì)于miR-7在上述惡性腫瘤的功能研究也取得了一定進(jìn)展[3,6-9]。如Okuda等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7可以通過(guò)調(diào)節(jié)KLF4的表達(dá)從而抑制乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移；也有研究發(fā)現(xiàn)，將miR-7在惡性膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)，可顯著抑制其遷移、侵襲能力，并且其作用機(jī)制可能與靶向下調(diào)EGFR表達(dá)相關(guān)[1]；Fang等[11]新近研究顯示，miR-7在體內(nèi)外均可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并可使肝癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，其主要作用機(jī)制是抑制了腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)途徑的傳遞。盡管miR-7在這些惡性腫瘤中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明，但這些研究結(jié)果均提示，miR-7在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮了抑癌基因的作用，且有望成為一個(gè)潛在的腫瘤基因治療的新靶標(biāo)。

我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，miR-7在正常肺組織中是高表達(dá)的[3]，而在臨床肺癌組織中，其表達(dá)水平顯著降低，且miR-7的異常表達(dá)(低表達(dá))與臨床肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。在本研究中我們進(jìn)一步利用基于CMV啟動(dòng)子的真核載體pcDNA3.1(-)-pri-miR-7過(guò)表達(dá)miR-7，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-7可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。更重要的是，我們構(gòu)建了人肺癌裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，并發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-7可以顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。與之一致的是，我們?cè)谛陆难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)miR-7可抑制TLR9信號(hào)通路促進(jìn)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。Xiong等研究也報(bào)道在腫瘤局部注射miR-7，可以抑制肺癌細(xì)胞的體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移[14]。此外，Veerla等[15]研究還顯示miR-7的表達(dá)水平與膀胱癌的轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，miR-7可能在人肺癌以及其它腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程中同樣發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

另外，近年Sema4C蛋白與腫瘤的相關(guān)關(guān)系也越來(lái)越受到關(guān)注。既往研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞遷移、血管發(fā)生等方面發(fā)揮了重要作用。如Jiang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Sema4C蛋白可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的交互作用，促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移；Zhang等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Sema4C蛋白的表達(dá)水平，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲和增殖。但目前有關(guān)Sema4C與肺癌之間關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。在本研究中，我們結(jié)合生物信息學(xué)分析和免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-7可顯著下調(diào)肺癌細(xì)胞內(nèi)Sema4C蛋白的表達(dá)，這提示miR-7有可能是通過(guò)下調(diào)Sema4C蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。據(jù)此，我們推測(cè)Sema4C基因的激活或過(guò)度表達(dá)在肺癌的轉(zhuǎn)移中可能具有重要作用，然而，其具體作用及相關(guān)機(jī)制仍待后續(xù)研究闡明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-7可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)、外轉(zhuǎn)移能力，這為后續(xù)深入研究miR-7與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制，以及為進(jìn)一步臨床肺癌基因生物治療新靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供了重要的前期實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

[1] Liu X,Sempere L F,Ouyang H,et al.MicroRNA-31 functions as an oncogenic microRNA in mouse and human lung cancer cells by repressing specific tumor suppressors[J]. J Clin Invest,2010,120(4):1298-1309.

[2]Okuda H, Xing F, Pandey P R, et al.miR-7 suppresses brain metastasis of breast cancer stem-like cells by modulating KLF4[J].Cancer Res，2013,73(4):1434-44.

[3]徐林，任濤，周涯，等.微小 RNA-7對(duì)人肺癌95D細(xì)胞體外增殖的作用[J].腫瘤,2010,30(9):763-767.

[4]徐林,任濤,秦安東,等.micro-RNA-7對(duì)人肺癌細(xì)胞體外侵襲的作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,34(1):12-16.

[5]宋永祥,李穎,秦安東,等. miR-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,34(4):440-5.

[6]Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 micrornas in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J]. Cancer Res,2004, 64 (11): 3753-3756.

[7]Johnson S M,Grosshans H,Shingara J,et al.Ras is regulated by the let-7 microrna family[J].Cell,2005,120 (5): 635-647.

[8]Esquela-Kerscher A,Trang P,Wiggins J F,et al.The let-7 microRNA reduces tumor growth in mouse models of lung cancer[J].Cell Cycle,2008,7(6): 759-764.

[9]Kumar M S,Erkeland S J,Pester R E,et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microrna family[J].Proc SNatl Acad Sci USA,2008,105(10):3903-3908.

[10]Okuda H, Xing F, Pandey P R, et al.miR-7 suppresses brain metastasis of breast cancer stem-like cells by modulating KLF4[J].Cancer Res,2013,73(4):1434-44.

[11] Kumar M S,Erkeland S J,Pester R E,et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microrna family[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(10):3903-3908.

[12]李穎，羅軍敏，徐林.miRNA-7在人肺癌中的表達(dá)、作用及初步應(yīng)用的研究[D].遵義:遵義醫(yī)學(xué)院，2012.

[13]Xu Lin,Wen Z,Zhou Y,et al. MicroRNA-7-regulated TLR9 signaling-enhanced growth and metastatic potential of human lung cancer cells by altering the phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3/Akt pathway[J].Mol Biol Cell,2013,24(1)：42-55.

[14]Xiong S D,Zheng Y J,Pei Jiang,et al. MicroRNA-7 Inhibits the Growth of Human Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells through Targeting BCL-2[J]. Biol Sci, 2011,7(6): 805-814.

[15]Ganti A K. Epidermal growth factor receptor signaling in nonsmall cell lung caner [J]. Cancer Invest, 2010,28(5):515-525.

[16]蔣學(xué)鋒. Sema4C調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的交互作用促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移[D].武漢:華中科技大學(xué)，2010.

[17]張磊,陳穎，劉文欣，等.Si RNA抑制Sema4C基因表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞惡性行為的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床，2010,37(16)：926-929.

TheeffectsofmicroRNA-7onthemetastasisofhumanlungcancer95Dcellsinvitroandinvivo

Zhushunfei1,Liaozhenyuan1，Huyan1，Chenchao1，Liyongju1，Liusijing2，Luojunmin1，Xiongsidong1,Xulin1

(1.Department of Immunology and Immunology Innovation Base of Postgraduate Education Department,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China; 2.The major of Anesthesia of 2011 level,Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of miR-7 overexpression on the metastasis of human lung cancer cells in vivo and vitro.MethodsThe eukaryotic expression vector of pcDNA3.1 encoding miR-7(termed as p-miR-7) was transiently transfected into human lung cancer 95D cells in vitro. The migration of cells was observed by scratch assay; the invasion of cells was observed by invasion assay. Moreover, human lung cancer metastatic model in nude mice was established. The metastasis of lung cancer cells was observed by HE staining. Finally, the expression of Sema4c was also detected by immunohistochemistry assay.ResultsOverexpression of miR-7 can significantly inhibit the metastasis and invasion of lung cancer cells in vitro (P<0.05). Moreover, compared to the control group, the metastasis of cancer cells in miR-7 overexpression cells was not observed in the lung (P<0.05). Finally, the expression levels of Sema4C protein were also remarkably decreased (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-7 could significantly inhibit the metastasis of human lung cancer cells in vivo and vitro, indicating a new target for subsequent lung cancer gene therapy.

lung cancer;miRNA-7;metastasis;invasion;sema4C; biotherapy

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO:81260398)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目(NO:NCET-12-0661)；貴州省國(guó)際合作項(xiàng)目(NO:10C315)。

徐林，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤免疫,E-mail:xulinzhouya@163.com。

R737.33

A

1000-2715(2013)05-0401-05

[收稿2013-07-27;修回2013-09-12]

(編輯：譚秀榮)